高通量蛋白纯化
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高通量蛋白纯化
为了尽可能地提高蛋白质的纯度，而同时又避免纯化过程中过大的工作 强度，习惯于在目标蛋白质上贴上一个纯化标签。Stevens(2000)的文章给出了一个全面的可用融合标签的目录。一般来说，比较长的标签，如硫氧 还蛋白(La Vallie等，1993)、麦芽糖结合蛋白(山Guan，Riggs和Inouye，1988)和谷胱甘肽转移酶(Smith和Johnson，1988)都有明显的优势，即它们都能够增加蛋白质的溶解度，并且能够克服某些影响表达的因素，提高表达水平(Kapust和Waugh，1999)。这些标签对于小肽来说也是适用的，例如对于半抗原的表达(半抗原可以用来培养抗体)。这些蛋白质标签的一个缺陷是不能用于变性纯化条件，也就是说不能纯化以包含体形式表达的蛋白；第2个缺陷是大标签可明显干扰目标蛋白质在随后的结构分析中的应用。为了克服后面这个问题，大多数大标签都用蛋白酶切除了。然而，这要求增加至少一个额外的纯化步骤，而且高通量流水线完成这样的任务是困难的，因为蛋白酶切割的成功率变化很大，这会导致产量的明显下降。因而，一些小标签如聚精氨酸(Smith等，1984)、生物素受体肽(Morag，Bayen和Wilchek，1996)、聚组氨酸(Hochuli等，1988)标签，它们能够在目标蛋白质的N端或C端引入一个6～13个残基的标签，这对于标准化和自动化的并联纯化来说是一个更加方便的选择。另外，这些小标签并不影响目标蛋白质的结构与功能。对于编者采用的表达和纯化的流水线来说，采用了6个组氨酸的标签，因为它有结构生物学成功应用的记录(Bucher，Evdokimov和Waugh，2002)。然而编者实验室初期的实验表明，组氨酸标签融合蛋白的整体表达水平没有大标签融合蛋白的表达水平高。因此探讨了通过在6个组氨酸的标签中引入一个短的转移先导序列以增加目标蛋白质表达水平的可能性。增加的6个氨基酸，象征着硫氧还蛋白的N端序列，较大程度地提高了蛋白质的表达水平，这在编者所有的细菌表达载体中都得到了应用。
并行纯化96个蛋白质的自动仪
仅采用原来分离和纯化核酸的仪器以及稍加修改的方法就可以实现毫克级水平的蛋白质的并联纯化。处理大批量细胞培养物的商业可行性自动仪现在还没有问世，这要求编者为其纯化流程发展一套特别定制的仪器。基于96管发酵槽的设计，编者开发了一个纯化自动仪，它可以进行一些基本的蛋白质抽取和纯化步骤，包括缓冲液的离心、抽滤和分弃，以及在某时间利用超声波对96管细胞培养液进行细胞溶解。如果最终得到上清液中含有表达的可溶的目标蛋白，还要将上清液加载至装有事先平衡好的Ni-NTA树脂的色谱柱中。纯化自动仪然后通过一个标准的洗涤和洗脱程序来运行。所有的步骤都由温度控制，以尽量减少蛋白质的聚集和降解。很明显，以包含体形式表达的蛋白质不能用这种特殊的方案收获。为了收集不可溶的蛋白质并进行再折叠的研究，这套程序应该修改，以便可以溶解包含体和利用变性条件纯化这些蛋白质。在使用适当的标签之后，这些包含体可以成为有效的抗原(Knuth等，2000)。使用这套自动化仪器，可以在6h之内完成纯化一组96个单个的目标蛋白，并可借助于尽可能少的专业人员就可以完成96个蛋白质日常的发酵和蛋白质纯化，包括介质的分离、仪器的消毒和利用SDS胶的分析来评价蛋白质的纯度和量。纯化的蛋白质的量一般都超过6～7mg，甚至可以达到每个样品40mg。经进一步色谱分离之后，蛋白质的纯度可以达到80％以上，这对于绝大多数应用如抗体制备或利用小分子文库进行的基于靶标的高通量筛选来说是足够了。对于一些有特殊应用要求的研究(如结构)，就需要加上另外的纯化步骤。为了满足更高的质量标准，编者在HPLC系统上又采用离子交换色谱，实行了标准的二次纯化程序，并装配了自动取样器。一个最后的可选择的纯化步骤包含凝胶过滤色谱，这对于缓冲液交换是很方便的。
为了尽可能减少及发现发酵和纯化时的错误，96个蛋白质的并联表达和纯化每天需要几个质量检验点。为了用生长的特征来检测一个发酵管是否成功，编者依据细胞培养液是否表达GFP蛋白来作为一个控制指标。如果一个发酵槽因为介质、通风和孵育温度的不合适而导致发酵失败，GFP蛋白将不会表达。
第二个检测点是根据SDS凝胶电泳检测的纯化蛋白质的表观分子量。这可以识别出与错误标记和错误操作相关的错误以及纯化自动仪指标不准的错误。最后，最重要的检测是在蛋白质纯化的最后阶段做的，即对每个纯化蛋白质经胰蛋白酶作用的产物进行质谱分析，这可以对纯化的蛋白质进行明确无误的鉴定。
