遗传分析在疾病相关基因搜寻和克隆中的应用
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遗传分析在疾病相关基因搜寻和克隆中的应用
利用遗传 分析定位克隆致病相关基因的成功例子很多，典型的是家族性心房颤动的克隆。心房颤动(atrialfibrillation)简称“房颤”，是一种十分常见的心律失常，心房发生350～600次／分不规则的冲动，引起不协调的心房乱颤，心室仅接受部分通过房室交界区下传的冲动，故心室率为120～180次／分，节律不规则。据统计，60岁以上人群中，房颤发生率为1％，并随年龄而增加。房颤分为两类：一类是由遗传造成的，属先天性房颤；另一类为后天形成的，为获得性房颤，是由风湿性心脏病、高血压、冠心病和甲状腺功能亢进等疾病引发的。早在1850年，西方学者Hoffa等就发现房颤的存在，然而，150多年过去了，房颤的发生机制依然莫衷一是，至今房颤依旧是现代医学所面临的一大挑战。
2003年，同济大学与国家人类基因组南方研究中心合作，成功克隆了家族性房颤的致病基因，该项研究成果发表在Science杂志上，它为房颤机制研究、新药研制和特定人群的基因诊断奠定了部分坚实的基础。该研究是在一个房颤的大家系中所发现的。这个大家系由4代、65人组成，存活的房颤患者有15人。所有的家系成员均经过详细询问病史、体格检查、标准12导联心电图和二维超声心动图检查。以心电图作为房颤的诊断依据，并排除了器质性心脏疾病和其他危险因素，如充血性心力衰竭、高血压和糖尿病等。家系中，患者房颤的诊断年龄是24岁，其实际的发病年龄更小。约有一半的患者没有症状，3例患者曾发生过脑梗死，5例患者有明显的心悸，2例患者身体虚弱、头晕、昏迷或接近昏迷状态。所有存活的房颤患者均进行了脑电图、肌电图、纯音听阈测试和血浆电解质化验，并对其中11例房颤患者进行了24小时心电图检测，各种检测均表现为正常。共收集了44份血样。
房颤家系图
经家系分析和疾病诊断后，研究者首先利用微卫星，对家系成员进行了全基因组扫描。这些荧光标记的微卫星标记引物分别标有FAM、HEX、NED 3种不同的荧光标记物，在激光扫描下分别显示蓝色、绿色和黄色，并根据其所扩增片段的大小及荧光标记的不同分成不同的组，每组5～14对引物，分别进行多重PCR和凝胶电泳。含有荧光标记物的电泳条带经ABI―377测序仪激光扫描后将数据存人电脑，经GENESCAN 3．0软件处理后转换成图像文件，再经过GENOTYPER 2．1软件分析后得到每个样本不同位点的基因型结果。将每个样本不同位点的基因型结果按其在染色体上的位置依次排列，并结合其表型做成数据文件，利用LINKAGE软件包(5．1版本)中的MLINK程序进行两点连锁分析。房颤是完全外显的显性遗传的，因此LOD计算时疾病基因频率设为0．001。单倍型分析采用手工计算。通过连锁分析，结果却很失望，LOD值小于1．o。经反复搜寻原因后发现，该家系里有部分后代是非直系的或无血缘关系的，最终收集的具有家系血缘关系的只有39人。由于混淆了这部分人，必然导致家系连锁分析的偏差。研究人员去除这部分无血缘关系人的数据后，重新对该家系中有血缘关系39人的数据进行了连锁分析。结果发现在D11S4181微卫星处LOD值达4．46，明显大于3．0，表明在DllS4181附近的确存在房颤的致病基因。D11S4181位于11号染色体末端，研究人员随后对该区域内加大微卫星密度进一步扫描。结合单倍型分析，将房颤致病基因定位在D11S1363与D11S1346之间，进一步缩小到19．6cM(约12Mb)。
人体的正常心率受窦房结细胞控制，窦房结细胞的自律性是由细胞膜上各种离子通道共同作用的结果。若离子通道异常，必然引起窦房结细胞自律性的改变，从而导致心率的改变，因此房颤很有可能是离子通道发生了异常改变。故在搜寻房颤致病基因时，首先应该考虑与离子通道有关系的基因。按照这个思路，研究人员对该区域内与离子通道功能相关的基因逐个进行了筛查，最终在第11号染色体的末端找到编码钾离子通道亚基之一的KCNQl基因。由于KCNQl突变可造成长Q―T间期综合征，表现为心律失常、心电图显示Q―T间期延长、晕厥，甚或猝死，因此KCNQl是房颤首选候选基因。经测序发现，家系中所有房颤病人的KCNQl基因的第418位A都变成了G，这种突变导致编码离子通道的第140位丝氨酸变为甘氨酸(图1―7)。这种突变仅存在于家系患房颤的病人之中，家系中的正常人和数百个无血缘关系的正常对照者无此突变。之后，将突变基因和辅助基因(KCNEl、KCNE2和KCNE3基因)导人COS―7细胞内，并使之表达相应的离子通道。通过细胞电生理学分析发现，该突变使两种钾离子通道(S140G KCNQl―KCNEl和S140GKCNQl―KCNE2)的导电性比正常钾离子通道(wKCNQl―KCNEl和wKCNQl―KCNE2)均有大幅度提高，同时还显著改变了这两种钾离子通道的其他一些门控特性。由此证明该突变(S140GKCNQl)是致病突变，KCNQl基因为家族性房颤的致病基因。家族性房颤致病基因的发现为房颤机制研究和新药研制提供了重要启示，也可能给特定的人群带来房颤的早期诊断。
房颤家系中房颤患者KCNQl错义突变(S140G)的DNA和氨基酸序列
定位克隆实验过程非常简单，其关键在于家系资料和表型分析。由于研究人员一开始未能发现该家系中有部分非血缘样本，以致连锁分析失败，因此在定位克隆时，全面完整的家系资料至关重要。另外，所收集的所有家系人员均应进行临床检测，分析家系成员中的患者系原发性疾病还是继发性，是否有不同的疾病亚型，排除家系中无临床症状的患者，从而保证家系成员表型的准确性，使得在应用连锁分析定位染色体区域后，利用“功能明确候选基因策略”并结合功能研究成功地定位克隆了家族性房颤的致病基因。因此，有效的研究设计是成功定位疾病相关基因的重要决定因素。研究者必须熟悉疾病的病理生理学和所研究对象的群体历史，并设立家系研究或疾病对照组以获得最大的效率。
