启动子功能性分析的方法

互联网2010-12-02

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启动子功能性分析的方法

对基因启动子的瞬时转染分析研究必须经过下列步骤：①确定需要转染的细胞系；②鉴定目的基因的假定启动子区域；③选择报告基因和相应的报告基因分析方法；④将启动子插入到合适载体的报告基因上游；⑤选择合适的转染方法。

1．确定需要转染的细胞系

用于瞬时转染分析的细胞必须具备以下条件：①细胞应表达含有目的启动子的内源基因；②必须具备将质粒DNA转染人细胞的方法；③能使培养物中的细胞在2―3天内保持数目恒定，以确保实验的完成。

2．鉴定目的基因的假定启动子区域

基因组克隆分离启动子通常是以全长cDNA的5’末端为探针筛选基因组文库。从基因组中分离启动子区域后，确定转录起始位点，对起始位点周围序列测序并开展功能性分析，以鉴定相关的调控元件。

3．选择报告基因和相应的报告基因分析方法

对真核基因调控的了解，主要来自野生型和突变型的假定顺式作用调控元件的活性测定实验，这些实验是在转染的真核细胞中进行的。在大多数情况下不直接测定调控元件的调节转录速率的能力，而是把顺式调控元件与报告基因(reportergene)的基因序列连接起来，在基因的转录过程中，测定细胞内报告蛋白的含量或活性，来判断顺式调控元件的调控能力。虽然这是一个间接的方法，但却是一种可行，而且有时是唯一的方法。

4．将启动子插入到合适载体的报告基因的上游

要分析启动子的活性，就要将假定的启动子序列插入到报告基因的上游。插入报告基因的DNA片段，必须首先确定翻译起始密码子和转录起始位点的位置。一般来讲，研究启动子片段下游的界限应选在转录起始位点和ATG之间。插入报告载体启动子片段的上游界限很难确定，可以参考相关文献的报道，因为特定家族的基因间可能存在相似机制。如果目的调控区是一个启动子，且置于紧靠报告基因的上游，则这种启动子就能驱动报告基因的转录。如果目的调控区是在启动子的远距离处起作用的增强子或其他调控区，通常将分析较透彻的启动子插到报告基因的上游，将增强子插到启动子的上游或报告基因的下游。下游位置通常是首选的，因为在启动子的邻近部位安置一个增强子会改变其特性，使某个元件和附近的启动子元件发生异常协同作用。