报告基因载体

报告基因载体

    (1)报告基因 载体的特点：除了具有表达蛋白质所需要的结构外，理想的报告基因载体本身无调节结合位点或序列，而具有有意插入的调节结合位点，尽管可以从报告基因载体除去已知的结合位点，减少报告基因上游的转录，但从几千kb的DNA中去除所有潜在的调控序列是不可能的。因此在使用报告基因载体时，应使用合适的对照载体。报告基因质粒载体一般在大肠杆菌中繁殖，因此包括一个DNA复制起始点(ori)和基因筛选标记，通常为氨苄西林抗性基因(Ampr)。另外还具有丝状噬菌体复制起始点(flori)，可使载体形成单链DNA，便于基因突变和测序。

 

    (2)报告基因和侧翼区：报告基因编码区和侧翼区常被改变。例如，去除SEAP羧基末端24个氨基酸，使SEAP能直接分泌到细胞外，因此测定SEAP活性不必裂解细胞。去除荧光素酶的过氧化物酶体靶向序列，使荧光素酶转运到细胞质而非过氧化物酶体中。为了使报告基因表达最大化，核糖体最佳结合序列(GCCGCCCCATG)被置于报告基因的5’端。此序列能增加翻译效率，产生NcoI酶切位点，可使外源基因N末端与报告基因融合。

 

    (3)多克隆位点：许多报告基因含有2个以上克隆位点(MCS)，一个位于报告基因上游，用于插入假定的克隆启动子或增强子／启动子区；另一个位于其他位置，用于插入克隆调控元件，例如插入可远距离发挥作用的增强子。另外，还有用于插入基因筛选标记的克隆位点，用于筛选稳定表达报告基因的宿主细胞。MGS具有几个单酶切位点，用限制性内切酶催化可产生黏性末端。DNA片段可插到此位点。MCS还包括一个或两个MCS末端，此末端序列可由限制性内切酶催化断裂形成3’悬垂末端，可用核酸外切酶Ⅲ进行嵌套缺失分析。

 

    (4)多聚腺苷酸信号：多聚腺苷酸(polyA)可增强哺乳细胞mRNA稳定性和mRNA的翻译。polyA序列紧随报告基因之后，可指导RNA转录物3’端添加200～250个腺苷酸残基。在转录单位5’端插入polyA信号能降低源于载体的隐匿启动子序列基因表达水平，去除背景表达，增加报告基因系统的灵敏性。在报告基因转录单位上游3个阅读框中均插入终止密码子，可进一步降低源于载体的假转录背景。

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