激光扫描共焦显微镜的应用
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激光扫描共焦显微镜的应用
激光 扫描共焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)在传统荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合计算机对荧光图像进行加工处理，观察细胞和组织内部各个层面或不同侧面的形态变化。激光扫描共焦显微镜集激光技术、电子技术、光学设计及计算机于一体，它的优势为具有更高的分辨率，更大的反差，更大的视野厚度，它可实现无损伤连续的光学切片和真实三维结构的再现，除可以对细胞内被标记物定位之外，还可以进行定量，并能够实时跟踪记录细胞生理信号的变化。
激光扫描共焦显微镜的功能决定了其在生物医学中应用及独特的地位，它能对完整的活细胞和组织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量、定时和定位的测量。我们用不同颜色的荧光二抗标记两种不同的蛋白质，就能对这两种蛋白质的细胞定位以及蛋白质间是否相互作用进行观察。如果我们研究的对象是受体，借助标记荧光素的配基与受体的结合，可以用共焦显微镜研究受体在细胞内的三维分布，也可以用不同颜色荧光素标记的二抗同时检测受体及与其相互作用的配体。
受体本身既可以是蛋白质、多肽，也可以是糖蛋白或糖脂。蛋白质类受体可以用抗体来标记，即用免疫荧光法进行标记。在受体定位、定量的研究中可以用受体蛋白特定部位的抗体来标记受体，对受体进行定位。标记的方法通常有直标和间标：直标是指受体的一抗直接带上荧光素对受体进行标记；间标有信号放大作用，但非特异性荧光也会较高。通常受体蛋白表达量较低，可采用间标法来进行标记，而且间标的样品也较适合用共焦显微镜来采集图像。
样品观察的一般步骤
(1)根据荧光素的激发波长和发射波长，选择合适的激发波长、分光镜滤片和发射滤片。
(2)确定扫描方式，xyz或xzy。
(3)确定扫描密度(分辨率)，128X128，256X 256，512X 512，1 024X1 024。
(4)选取物镜的倍数及电子放大倍数。这两个条件确定后，扫描范围(大小)即被确定。
(5)根据样品的制备质量选择合适的针孔大小。若针孔的大小以AriyDisk为单位，通常将针孔设为1。如果样品的荧光标记非常弱，可以适当将针孔调大。
(6)确定光切范围，即扫描样品的厚度，锁定起始(beginning)位置和结束(end)位置。
(7)给出光切得层书记去图时累积平均次数(采集图像时累计平均的目的是去除随机的噪声信号，平均次数越多，信噪比越好)。
与成像质量相关的五大要素
(1)激光功率的大小：通常激光功率越大，图像的信噪比越好，但样品荧光越容易被淬灭。所以激光功率通常要尽可能小。
(2)探测针孔的大小：探测针孔越大，进入光检测器的信号(发射荧光)越多，信噪比越好，但样品的成像厚度也越厚。如果要进行被标记物的精细定位，探测针孔应尽可能小。
通常探测针孔设置为1(AriyDisk)。但当荧光信号非常弱时，可适当增大探测针孔。要想提高图像质量，还可以同时增加取图的累计平均次数。
(3)扫描速度的大小：扫描速度越慢，图像信噪比越好，但也越容易发生光漂白。通常选择仪器的标准扫描速度即可。
(4)光电倍增管增益的大小：光电倍增管增益越大，信号越强，但过大信噪比变差。当荧光信号较弱时，适当增大光电倍增管增益，并增加取图的累计平均次数。
(5)物镜的选择：可以说物镜是成像质量关键要素之一，荧光进入物镜的通透量的多少与物镜的光透射率有关，而物镜的光透射率与数值孔径(NA)的4次方成正比，与物镜的放大倍数的平方成正比。因此，应尽量选择高数值孔径的物镜，即通常应选择油镜或水镜。
