激光扫描共焦显微镜及其在生物医学方面的应用

激光扫描共焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM），有时也被称为激光扫描细胞仪（Laser Scanning Cytometer，LSC）是八十年代迅速发展起来的用于分析细胞学的新型仪器。LSCM与普通光学显微镜相比优点明显，分辨率、灵敏度、放大率和荧光检测信噪比大大提高。对活细胞可以做分层扫描后，进行三维重建和测量分析，对细胞内微细结构的动态变化可进行定性、定量、定时和定位分析检测，可通过荧光标记检测细胞内离子浓度的变化比例及动态变化。因此LSCM是细胞神经生物学和生理学，药物学及遗传学等生物医学领域的新一代研究工具。

1．LSCM的发展简况

激光扫描共焦显微镜是在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共轭聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。1971年美国Davidovits和Egger发明了以激光为光源的透镜扫描系统，1978年Sheppard等推出了载物台扫描装置。1979年有了样品扫描装置，1980年Koestert等介绍了镜扫描系统，1983到1986年，Aslund和Carlsson等介绍了双镜扫描系统和共轭聚焦成象系统。1984年第一台LSCM实用产品问世，十多年来LSCM的应用有了飞速发展。我国在1990年引进五台LSCM，到了1997年已有了三十多台设备。产品主要来自四家公司，美国的Bio-Rad和Meridian公司，德国的Zeiss和Leica公司。

2．LSCM的基本原理

普通光学显微镜使用的卤素灯光源为混合光，光谱范围宽，成象时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成像质量，LSCM结构上采用双针孔（Pinhole）装置，形成物像共轭的独特设计，激光经物镜焦平面上针孔形成点光源对样品扫描，于测量透镜焦平面的探测针孔处经空间滤波后，有效地抑制同焦平面上非测量光点形成的杂散荧光和样品不同焦平面发射来的干扰荧光。这是因为光学系统物像共轭，只有物镜焦平面上的点经针孔空间滤波才能形成光点图像，扫描后可得到信噪比极高的光学横断面，分辨率比普通光学显微镜提高1.4倍。LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，成像聚焦后焦深小，纵向分辨率高，可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体结构，这种功能被形象的称为“显微CT”。

3．LSCM的结构特点

LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。常用计算机为奔腾系列，内存最好是64MB，以便于图像的存取和运算，软件界面多数为Windows或Windows NT，后者图像采集效率更高，软件也可在互联网上方便地更新。

3.1 显微镜光学系统

显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。显微镜光路以无限远光学系统为佳，可方便地在其中插人光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜为好，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。多功能显微镜以德国的蔡司Zeiss和莱卡Leica的产品为好，也常用日本的尼康Nikon或奥林巴斯Olympus产品。