激光扫描共焦显微镜及其在生物医学方面的应用

激光扫描共焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM），有时也被称为激光扫描细胞仪（Laser Scanning Cytometer，LSC）是八十年代迅速发展起来的用于分析细胞学的新型仪器。LSCM与普通光学显微镜相比优点明显，分辨率、灵敏度、放大率和荧光检测信噪比大大提高。对活细胞可以做分层扫描后，进行三维重建和测量分析，对细胞内微细结构的动态变化可进行定性、定量、定时和定位分析检测，可通过荧光标记检测细胞内离子浓度的变化比例及动态变化。因此LSCM是细胞神经生物学和生理学，药物学及遗传学等生物医学领域的新一代研究工具。

1．LSCM的发展简况

激光扫描共焦显微镜是在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共轭聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。1971年美国Davidovits和Egger发明了以激光为光源的透镜扫描系统，1978年Sheppard等推出了载物台扫描装置。1979年有了样品扫描装置，1980年Koestert等介绍了镜扫描系统，1983到1986年，Aslund和Carlsson等介绍了双镜扫描系统和共轭聚焦成象系统。1984年第一台LSCM实用产品问世，十多年来LSCM的应用有了飞速发展。我国在1990年引进五台LSCM，到了1997年已有了三十多台设备。产品主要来自四家公司，美国的Bio-Rad和Meridian公司，德国的Zeiss和Leica公司。

2．LSCM的基本原理

普通光学显微镜使用的卤素灯光源为混合光，光谱范围宽，成象时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成像质量，LSCM结构上采用双针孔（Pinhole）装置，形成物像共轭的独特设计，激光经物镜焦平面上针孔形成点光源对样品扫描，于测量透镜焦平面的探测针孔处经空间滤波后，有效地抑制同焦平面上非测量光点形成的杂散荧光和样品不同焦平面发射来的干扰荧光。这是因为光学系统物像共轭，只有物镜焦平面上的点经针孔空间滤波才能形成光点图像，扫描后可得到信噪比极高的光学横断面，分辨率比普通光学显微镜提高1.4倍。LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，成像聚焦后焦深小，纵向分辨率高，可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体结构，这种功能被形象的称为“显微CT”。

3．LSCM的结构特点

LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。常用计算机为奔腾系列，内存最好是64MB，以便于图像的存取和运算，软件界面多数为Windows或Windows NT，后者图像采集效率更高，软件也可在互联网上方便地更新。

3.1 显微镜光学系统

显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。显微镜光路以无限远光学系统为佳，可方便地在其中插人光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜为好，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。多功能显微镜以德国的蔡司Zeiss和莱卡Leica的产品为好，也常用日本的尼康Nikon或奥林巴斯Olympus产品。

3.2 扫描装置

LSCM使用的扫描装置有两类，台扫描系统和镜扫描系统。现在也有两者结合使用的仪器。台扫描通过步进马达驱动载物台，位移精度可达0.lμm，能够有效地消除成象点横向像差，使样品信号强度不受探测位置的影响，可准确定位定量地扫描检测视野中每一物点的光强度，缺点是载物台机械移动、图像采集速度较慢。镜扫描有双镜扫描和单镜扫描两种，通转镜完成对样品的扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图像采集速度大大提高，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定，但因光路略有偏转会对通光效率和像差有所影响。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。

3.3 激光光源

LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。氪氩离子激光器是可见光范围内使用的多光谱激光，发射波长488nm、568nm和647nm分别为蓝光、绿光和红光，大功率氩离子激光器是紫外和可见光混合激光器，发射波长为351～364nm、488nm和514nm分别为紫外光、蓝光和绿光，单个激光优点是安装方便，光路简单，但价格较贵并存在不同激光之间的光谱竞争和色差校正问题。多激光器系统在可见光范围使用氩离子激光器，发射波长为488nm和514nm的蓝绿光，氦氖激光器发射波长为633nm的红光，紫外光选用氩离子激光器，波长为351～364nm。其优点是各谱线激光单独发射，不存在谱线竞争的干扰，调节方便，但光路复杂，光学系统共轴准直调试要求高。1996年新型双光子激光器问世，利用双光子倍频效应，使用可见光激光来代替紫外激光作激发光源达到检测紫外探针的目的。双光子激光能使活体细胞荧光损伤减少，成像质量改善，增强对样品深层的观察能力。通过计算机控制的声光调制器可进行各波长光谱之间高速切换以及迅速改变激光光斑、强度和照明时间。

3.4 检测系统

LSCM为多通道荧光采集系统，光路上要求至少有三个荧光通道和一个透射光通道，如有第四荧光通道更好，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。每个PMT前设置单独的针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要。通过在线视频打印机或数字照相机可以实时拷贝图像和制作幻灯。

4．LSCM的生物医学应用

LSCM的高灵敏度、高分辨率、高放大倍数，提供了光学显微镜无法显示的结构，使细胞生物学研究上了一个台阶。目前我们可以在亚细胞水平进行动态实验，检测细胞生物质和离子通道的变化，观察细胞在生理、病理和药理情况下对外界因素作用所产生的快速反应，进行定性、定量、定时和定位的分析测量。最常用的功能是细胞三维重建，细胞荧光检测和细胞显微操作等。

4.1 细胞的三维重建（3-D Reconstruction）

普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像迭加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色图像处理，双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析，染色体分析，细胞程序化死亡的观察，细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。

4.2 细胞定量荧光测定

显微荧光光度计由于显微镜和激发光源的限制成像模糊，只能测定细胞内的荧光总量，有一定的误差。LSCM以激光为光源，对细胞分层扫描，单独测定，经积分后能得到细胞荧光的准确定量，重复性极佳。它适于活细胞的定量分析，可测定细胞内溶酶体、线粒体、DNA含量、RNA含量、酶和结构性蛋白质等物质含量和分布，常用于原位分子杂交，肿瘤细胞识别，单个活细胞水平的DNA损伤及修复的定量分析。它适于快速高灵敏度测量，减少光粹灭的影响，在定量免疫荧光测定方面应用广泛，如作各种肿瘤组织切片抗原表达的定量分析，监测肿瘤相关抗原表达的定位定量信息，监测药物对肌体免疫功能的作用，监测自身免疫性疾病的多种抗原及药物对肌体免疫功能的作用，监测细胞结合和杀伤的形态特征并作定量分析等。细胞定量荧光测定可选用单荧光。双荧光和三荧光方式，能自动测定细胞面积，平均荧光强度，积分荧光强度及形状因子等多种参数。

4.3 细胞内钙离子PH值和其它离子的动态分析

通过Indo-1、Fluo-2、Fluo-3、Calcium green、SNARF等多种荧光探针，可对细胞内钙离子、钠离子及PH值等作荧光标记并对它们进行比率值和浓度梯度变化测定。由于细胞内钙离子为传递信息的第二信使，对细胞生长分化起着重要作用，通过单标记或双标记对细胞内钙离子和其它离子的荧光强度和分布精确测定，测定样品达到毫秒级的快速变化。借助光学切片功能可以测量样品深层的荧光分布以及细胞光学切片的生物化学特性的变化。通过不同时间段的检测可测定细胞内离子的扩散速率，了解它对肿瘤启动因子、生长因子等刺激的反应。细胞内离子测量广泛用于肿瘤研究、组织胚胎学、细胞生物学和药理学等领域。

4.4 细胞胞间通讯（Cell Communication）和膜的流动性

动物和植物细胞中缝隙连接介导的胞间通讯在细胞增殖和分化中起着重要作用。通过测量细胞缝隙连接分子的转移，可以研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用及细胞内钙离子、pH值等对缝隙连接作用的影响，并监测环境毒素和药物在细胞增殖和分化中所起到的作用。选定经荧光染色后的细胞，借助于光漂白作用或光损伤作用使细胞部分或整体不发荧光，实时观察检测荧光的恢复过程，可直接反应细胞胞间通讯结果。

细胞膜的流动性在进行膜的磷脂酸组成分析，药物作用点和药物作用效应，测定温度反应和物种比较方面有重要作用。细胞膜荧光探针受到极化光线激发后，发射光极性依赖于荧光分子的旋转，这种有序的运动自由度取决于荧光分子周围的膜流动性，所以极性测量能间接反映细胞膜的流动性。

4.5 荧光光漂白恢复（Fluorescence Redistribution After Photo bleaching，FRAP）

FRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测，因而可得到活细胞的动力学参数。LSCM可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和恢复速率，反映细胞结构和活动机制。广泛用于研究细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子迁移率，细胞间通讯等领域。

4.6 笼锁-解笼锁测定（Caged-Uncaged）

这是一种光活化测定功能。生物活性产物或其它化合物处于笼锁状态时，其功能封闭，一旦被特异波长的瞬间光照射后，产生光活化解笼锁，恢复原有的活性和功能，在细胞增殖分化等生物代谢过程中发挥功能。LSCM可以控制笼锁探针的瞬间光分，选取特定的照射时间和波长，从而达到人为控制多种活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。它们包括第二信使、核甘酸、神经介质、钙离子。

4.7 粘附细胞分选（Adhered Cell Sort）和显微手术（Micro-operation）

采用台扫描方式的LSCM，由于激光束固定在显微镜的光轴上，可对载物台上的样品作精确地定位扫描，从而对所要选择的细胞进行分选，Meridian公司的LSCM能够理想地进行这项工作，在不改变细胞培养周围环境，细胞铺展程度和生长状态情况下进行细胞分选。分选方法有两种，一种是光刀切割法（Cookie－Cutter），将细胞贴壁培养在特制培养皿上，利用高能激光在所选细胞周围作八角形切割，只在其间保留所选细胞，选择条件取决于特定荧光和细胞形态学参数，这种分选方法特别适用于选择数量较少的细胞，如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞等。第二种方法是激光消除法（Laser Ablation），用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整的活细胞亚群继续培养，这种方式取决于细胞荧光特性，特别适于对数量较多的细胞选择。

通过这两种方式可以总体扫描细胞群，进行细胞物理和生化特性的选择。能对百万分之一机率发生突变的细胞作筛选，能不改变细胞类型、形态和活性而克隆细胞，能分离细胞亚群并进行定量荧光检测，能存储细胞位置对特定细胞重复测定。这种细胞分选方式效率和精确度都很高。

借助LSCM我们可以把激光作为光子刀应用，来完成细胞膜瞬间打孔，线粒体、溶酶体和染色体的切割，以及神经元突起切割等显微细胞外科手术。

4.8 激光光陷阱技术（Optical trap）

激光光陷阱技术又称为光摄技术，就是利用光学梯度力形成的光陷阱，产生具有传统机械镊子挟持和操纵微小物体的功能。当微米级范围的颗粒落人一个非均匀光场中，它将趋于特定的平衡位置，如果没有外界强有力的干扰，物体不会偏离光学中心。由于外界作用和粒子自身运动等原因产生的中心偏离也会很快恢复原位，光造成一个势能较低的陷阱区域，当物体的动能不能克服周围势垒时，它将留在陷阱内。这种固定是光子动量的结果，与照明强度和波长直接有关。较大物体比较小的结构需要更多的陷阱能量。光摄可以在保持处在生产环境中的细胞仍可与外界沟通的条件下，对目标细胞进行非接触式的捕获与固定，井进行精确地操作，克服了以往单细胞操作中细胞难以固定和易产生机械损伤的弱点。这项新技术广泛应用于染色体移动，细胞器移动，细胞骨架弹性测量，细胞周期和调控研究及分子动力原研究等方面，尤其是在探测植物细胞骨架时，光陷阱是目前能探测其弹性和流变性的唯一技术。

综上所述，激光扫描共焦显微镜由于其高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点，在细胞水平上可作多种功能测量和分析，成为分析细胞学的一项重要研究手段。目前LSCM价格一般报价为150万至300万左右，用户基本集中在中科院系统和高等院校，随着LSCM设备和应用技术的不断完善，它在生物医学和生命科学领域里将起到更重要的作用，应用前景非常广泛。