杂交测序(sequencing by hybridization，SBH)
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杂交测序 (sequencing by hybridization ， SBH)
SBH概念的提出旨在发展一种快速、准确、高通量的测序方法，也是发展DNA芯片技术的初衷。它所基于的假设是完全匹配的互补探针捕获核酸的量最多、信号最强，捕获的核酸也是唯一的。将寡核苷酸探针固定到芯片上，待测样品中的标记DNA靶标与之配对，当配对的DNA有少至1个碱基的差异时，其Tm值的改变影响到杂交时的荧光信号值，从而可以判断待测样品与芯片上哪个片段结合，便可知待测的DNA序列上特定位点的碱基特征。所以在实际操作中，杂交必须保证能够区分完全匹配和不完全匹配的探针。如果芯片 上包含72个碱基长度的寡核苷酸探针的所有可能组合和未知的检测DNA序列杂交，理论上，检测核酸任意，1个连续碱基区段都能找到互补的固定探针并与之杂交，称之为完全匹配杂交。其杂交信号比含错配DNA的杂交信号强，根据完全匹配杂交探针的重叠序列排列，重组探针，再现检测核酸的序列，这种方法就是杂交测序。
SBH所选择探针的碱基个数受杂交技术的发展限制，也和所检测的核酸复杂度有关。选择的长度至少必须有一定灵敏度，11-15 nt杂交效率比较高，11个碱基的完全组合是4．2X106 条探针，8个碱基的完全组合也有48 ＝65 536条探针，但灵敏度低，也难于保证杂交的唯一性
8个碱基长度的SBH
注：4条是完全匹配杂交的探针，重组后确认检测核酸包含序列AG丁丁CGACTTAG
SBH的优点在于；陕速、成本低、易于自动化。但是，这种方法存在一些问题。第一，由于众多寡核苷酸的组成各不相同，其最佳杂交条件难于统一，易出现假阳性和假阴性的杂交结果；第二，根据获得的数据无法准确地排列重叠序列；第三，如果检测核酸存在重复序列，那么重叠的探针不是唯一的，重组探针无法再继续。所以，这种方法不能用于含有许多内部重复和简单序列单元的DNA。但这种方法用于再测序，即确认已知的核酸序列和研究单核苷酸多态性(SNP)的检测或突变具有其他方法不可比拟的优越性。虽然该方法的初衷是用于DNA测序，而实际上目前都是用于再测序，如SNP检测、突变分析、疾病分子诊断、基因分型等(图6-2A)。由于再测序芯片上的寡核苷酸片段是根据待测样品DNA的序列而特别设计的，因此又被称为等位基因专一性寡核苷酸(allele specific oligonucleotides，ASO)。
3种不同基于芯片检测SNP方法的原理示意图
注：丸直接杂交法；B．引物延伸法；C．连接酶检测法。灰线代表荧光标记的靶基因或报告探针，黑线代表未标记的靶基因；黑色箭头表示来标记的SNP位点，灰色箭头代表标记的SNP位点或标记并整合的ddNTP
