条件性基因敲除应用于研究基因的功能
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条件性基因敲除应用于研究基因的 功能
层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质中的一个重要成分，在调节细胞的生长和功能方面发挥重要的作用。层粘连蛋白是一个异源三聚体，由α、β和γ亚基构成。之前的研究表明，层粘连蛋白功能的缺陷可以导致肌肉营养失调和外周神经髓鞘形成障碍。全身性层粘连蛋白基因的缺失可以导致胚胎在胚胎发育第5天即发生死亡，因此用传统的基因缺失方法无法研究层粘连蛋白基因在外周神经系统中所发挥的功能。陈祖林等为了研究层粘连蛋白在外周神经系统中的作用，采用Cre―loxP系统在神经膜细胞中对层粘连蛋白进行条件性敲除。具体的研究方案如下：在层粘连蛋白γ1第1个内含子和第2个内含子中分别插入一个loxP位点，同时在第1个内含子中还插入一个neoR 基因作为筛选标记，并且在neoR 两侧各含有一个flp位点，用于去除neoR 基因，以避免neoR 基因序列的存在可能对小鼠造成的影响。在Cre转基因小鼠中，Cre重组酶被置于基因户。的启动子调控之下，使Cre特异性地只在神经膜细胞中表达，而在其他组织和细胞中不表达。这两只小鼠杂交后所产生的双转基因小鼠中，实现了层粘连蛋白Y1在神经膜细胞中的特异性敲除。试验设计及部分结果如图
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在神经膜细胞中敲除层粘连蛋白Y1基因的设计方案和敲除的结果
图中A表示在神经膜细胞中特异性敲除层粘连蛋白γ1基因时，第2个外显子与loxP位点及抗性基因的排列方式。B表示采用PCR方法检测层粘连蛋白Y1在神经膜细胞中特异性敲除的效果。从B中可以看出用PCR方法扩增出的野生型基因长度为1．3kb(泳道wt)，而loxP转基因小鼠用同样的引物扩增出的条带为3．2kb，表明层粘连蛋白Y1的第2个外显子两侧成功引入了loxP和neoR基因序列(泳道f／f)。在P。―Cre转基因小鼠中，用同样的引物在脑、肌肉和脊髓中扩增出的条带同样也为3．2 kb，表明在这些组织中靶基因的结构未发生变化(f／f，P0 ―Cre泳道脑、肌肉、骨髓)。而在外周坐骨神经中相应的条带变为了2．3kb(f／f，P。―Cre泳道坐骨神经)，这意味着在该组织中由于Cre重组酶的特异性表达导致loxP位点之间的第2个外显子发生了缺失，从而导致扩增出的条带相应缩短。进一步用免疫荧光法检测层粘连蛋白γ1的表达情况，发现成功地在外周神经中特异性敲除了层粘连蛋白γ1基因。
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免疫荧光检测坐骨神经中层粘连蛋白γ1的表达情况
图中a和b为野生型小鼠，c和d为f／f，P0 ―Cre转基因小鼠。从图中可以看出野生型小鼠的坐骨神经中层粘连蛋白Y1有比较强烈的表达信号，而转基因小鼠坐骨神经中的表达则明显降低。
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通过上述研究策略，陈祖林等发现，在神经膜细胞中特异地敲除层粘连蛋白γ1基因后，并没有导致小鼠的过早死亡。并且发现层粘连蛋白γ1缺失小鼠和野生型小鼠相比体形较小，表现为四肢麻痹和肌营养不良的一些症状。进一步的机制研究表明，该基因在神经膜细胞缺失后引起神经膜细胞的分化障碍，从而使外周神经髓鞘不能正常形成，影响到神经冲动的正常传递以及神经再生。该研究初步阐明了层粘连蛋白γl基因在外周神经系统中的作用，克服了全身敲除该基因后导致胚胎过早死亡的问题。
