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构建噬菌体肽库的密码子选择

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构建噬菌体肽库的密码子选择
要建立一定长度的肽库 ,首先就是要人工合成相应长度的核苷酸随机序列,理论上核苷酸序列随机性越大,则肽库的多样性就越丰富。如密码子采用NNN合成方式,理论上可以得到所有可能且完全随机的氨基酸序列。但实际上其中有很多序列因存在着终止子而得不到表达,因此要尽量减少终止子在核苷酸序列中出现的频率。终止子有3个:TAA、TGA和TAG,因此密码子的合成方式一般选择(NNK)n、(NNS)”或(VNN)n(N=A、G、C或T 4种核苷酸,K=G或T,S=G、C或T,V=A、G或C),这样可以在获得最大多样性的同时降低终止子出现的频率。如密码子采用NNK合成方式,则能够编码20种氨基酸和一个TAG终止子,这样就去除TAA、TGA终止子在随机核苷酸序列中出现的频率,其密码子的数目为4X4X2=32个,其中有12种氨基酸的密码子各有1个,5种氨基酸的密码子各有2个,3种氨基酸各有3个密码子。如果采用含有琥珀抑制基因的菌株时,琥珀终止密码子TAG则不被识别,TAG翻译为谷氨酸。由于各种氨基酸的密码子个数不同,因而在肽库中出现各种氨基酸的比例是不相同的,频率差异也较大。如Ser的密码子有3种,而Glu的密码子只有1种,这就意味着含有Ser的数量是Gtu的3倍。再加上各氨基酸单体在合成中的竞争活性也存在着差异,因此,库中氨基酸的分布并不均衡,序列中各种氨基酸的组成存在着偏歧现象,并且肽段越长,这种偏歧越明显。所以在构建较长的肽库时,可以采用双核苷酸尤其是三核苷酸的形式来代替单核苷酸合成的方法。所谓三核苷酸形式,即以3个核苷酸为1个密码子单位(即1个氨基酸1个密码子)进行合成。利用20种三核苷酸作为合成单位,就可调控加入的氨基酸种类和数量,可以有效避免终止子的加入,达到有效序列随机化的目的。但这种方法的缺陷就是要求特殊的三核苷酸合成原料,这在一般实验室很难获得。
如果将合成的一定长度核苷酸随机序列直接克隆人噬菌体载体中,所构建的是随机线性肽库,如果在核苷酸随机序列两侧插入两个半胱氨酸残基的编码序列,再克隆人噬菌体载体中,这两个半胱氨酸残基可以形成二硫键,使噬菌体展示的随机肽构成环状的空间构型,从而更加稳定这种肽称为限制性肽(constrained peptides)。这种环状的氨基酸空间结构可能与天然蛋白质的空间结构更易接近,可能会从中筛选到一些高亲和力结合的小肽。
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