电镜原位杂交的特点
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电镜原位杂交的特点
电镜原位杂交的原理和基本操作步骤与光镜水平的原位杂交相似，但电镜原位杂交不仅要求获得满意的杂交信号，而且还要求保持良好的超微结构。为了兼顾既保存较好的细胞超微结构又保证较好的杂交反应两者之间的关系，在电镜原位杂交中应注意以下几个特点：
1．选择合适的固定剂 所用固定剂最好为交联固定剂，如甲醛和戊二醛，既能良好保存细胞超微结构，又能有效地保存组织细胞中的核酸，尤其是RNA分子。这类交联固定剂，尤其是戊二醛，主要缺点是影响探针对靶核酸的可及性，当细胞中靶核酸序列的拷贝数很少时，这种影响尤为明显。所以。一般主张用较低浓度(0．1％一0．5％)的戊二醛或与4％多聚甲醛联合使用。在实验中可试用不同浓度的多聚甲醛和(或)戊二醛，以摸索最佳浓度。
锇酸是电镜技术中常用的一种固定剂，但经锇酸固定的组织，RNA的保留较差。在原位杂交技术中，标本在原位杂交反应后再用锇酸进行后固定似乎不影响标记信号，这样有利于膜结构的保存，可增加细胞亚微结构的电子密度反差。
2．选择合适的探针 放射性和非放射性探针都可用于电镜原位杂交。与光镜原位杂交反应一样，用放射性核素标记的探针做电镜原位杂交，其敏感性较高，标记物不干扰杂交反应，并且结果适于进行定量分析。常用的放射性核素为3H、35S、125I和32P。3H的β射线能量最低。杂交信号能得到最佳的亚细胞定位，但放射自显影的曝光时间较长。35S的β射线能量较高，故其亚细胞定位不如’H精确，但放射自显影时间较短，实际应用中应用最广。应用非放射性标记探针进行电镜原位杂交不需长时间进行放射自显影，又可避免放射性核素的污染问题，而且其分辨率即杂交信号的亚细胞定位要比放射性核素标记探针好。在电镜原位杂交中用得最多的非放射性标记物是生物素。杂交体上的生物素可用HRP或胶体金标记的抗生物素抗体、A蛋白或卵白素来检测。
如果用强交联剂固定，应选择较短序列的探针，使探针易于渗透，提高杂交反应效率。
3．适宜的杂交前处理 杂交前处理中应尽量避免蛋白
酶消化，去污剂Triton X-100的浓度也应降低，以不高于o．02％为宜。因醋酸酐处理能破坏细胞亚微结构，故应避免。
4．适宜的检测方法 电镜原位杂交的杂交信号必须具有高电子密度，只有这样才能在电镜下识别。
放射性核素标记探针电镜原位杂交的杂交体用放射自显影术检测。电镜放射自显影要求分辨率极高，与光镜放射自显影相比，专用于电镜放射自显影的核乳胶的银粒较细，一般要求银粒直径在1．6X10―；m以下。制备电镜自显影标本时，要求乳胶层薄到只有一层溴化银晶体的厚度，称为单层乳胶。在单层乳胶中，溴化银晶体彼此接近，既不互相重叠，又不留有无溴化银晶体的空隙。当超微结构中体积极小的放射源的核射线穿透单层乳胶时，只使距放射源最近的银粒曝光。而射线不作用于其他的银晶体上，不至造成影像弥漫泛化。
非放射性标记探针电镜原位杂交的杂交体，大多用免疫组织化学技术检测。各种电镜免疫组织化学技术，如免疫酶、胶体金及A蛋白等，都可用于电镜原位杂交。免疫酶法的敏感性较高，但由于酶反应产物在探针标记处聚集成较大的团块，故其分辨率较低。胶体金颗粒，特别是较大直径的胶体金颗粒在组织中的穿透性不如HRP，再则胶体金颗粒所带负电荷与组织中靶核酸的负电荷之间的相斥力都会影响胶体金标记的敏感性。采用小颗粒的胶体金或应用直径仅为1．4nm的纳米金(nanogold)能增加其组织穿透性；采用多步法的免疫组织化学技术或者将生物素通过一长的连接臂标记核酸探针，然后再用胶体金标记的抗生物素抗体或亲和素来检测，这样使金颗粒之间的距离增加，使两者之间的静电排斥力减小。采取这些措施，可使胶体金标记的敏感性增高。小颗粒胶体金或纳米金标记通过银加强后，其敏感性更高。
