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硝酸纤维膜固相杂交

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2046
 

核酸样品经过直接点样或转移到硝酸纤维膜上,固定后,可以进行杂交反应。在杂交溶液中,硝酸纤维膜上变性的核酸样品和变性后的探针在一定的条件下形成双链杂交核酸分子。然后进行酶标显色。
试剂及操作方法见本节 三。
五、真核细胞基因组的制备
从不同组织细胞或血细胞中提取是进行基因诊断的先决条件。制备的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净,又要保持分子的完整。蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取的反应体系中,SDS是离子型表面活性剂,主要作用是:(1)溶解膜蛋白而不破坏细胞 膜;(2)解聚细胞 中的核蛋白;(3)与蛋白质结合,使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸,使分子尽量完整地分离出来。具体方法如下:
(一)白细胞的制备
(1)采集外周静脉血10ml,加1.7ml ACD(柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2 灭菌30min)抗凝。
(2)将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内,加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2 、1%Triton –X 100],轻轻上下振荡至透明,红细胞 完全溶解。
(3)冰浴10min,离心,3000rpm,10min。弃上清,STMT重复处理1~3次。
(4)弃上清,白色沉淀物加10ml STE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)],先少量,充分混匀,然后加10mg/ml蛋白酶K100μl,20%SDS30μl,摇匀,置37℃水浴15~20h。
(5)用等体积饱和酚抽提,3000rpm离心5min。
(6)用大口钝缘吸管小心吸取上层水相,加饱和酚和氯仿-异戊醇(24:1)抽提,3000rpm离心5min 。
(7)小心吸取上层水相,用等体积氯仿-异戊醇(24:1),抽提,3000rpm离心5min。
(8)小心吸取上层水相,加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀,-20℃过夜。
(9)将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出,放入Eppendorf管内,加1ml 75%乙醇4℃静置1h,离心,10000rpm 10min。
(10)弃上清,用蜡膜将管口封好,针刺数个小孔,真空抽提(10~15min)。
(11)加200μl 1×TE溶解,置4℃保存。
(12)对所提用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。
(13)取2~4μl 样品,经琼脂糖凝胶(Agarose)电泳,检查所提的质量及降解情况。
(二)组织的制备
(1)将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎,加4ml 1×RSB缓冲液(10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4)放入10ml带盖的塑料管中。
(2)加SDS至浓度为1%(可加0.4ml10%SDS),混匀。由于从核中释放出来,样品变得粘稠。
(3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl,终浓度为100μl/ml,37℃保温1~3d,直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(4)用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇(24:1)各抽提一次,3000rpm离心5min,用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。
(5)加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段,并移入一新管,吸干中的无水乙醇。
(6)溶于4ml 0.1×SSC中,4℃过夜可作进一步纯化。
(7)加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。
(8)同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提,乙醇沉淀离心,弃上清。
(9)75%乙醇洗涤2次,离心,弃上清,真空抽干。适量1×TE溶解,保存在4℃。

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