植物组织培养苗之污染与检测

一、在组织培养中污染来源

1. 植物本身具有：

（1）植物病原菌
有些作物的病害已被透彻研究，因此在大量繁殖时，可立即检查出来，但有些则否，造成若有污染时，不知来源为何。

（2）和植物有关的菌类
有修植物本身便会和一些菌种共生，或是寄生于植物内部。 

2. 植物所带入的污染：内在污染源

许多植物表面或大气中生存的微生物，可经由植物自然的开口或伤口进如植物内部，而有一些兼性腐生菌或绝对寄生菌，可藉由载体或是拥有一些侵入的机制侵入植物内部，依其存在的地方分为

1. 细胞内－inter
2. 细胞间隙－interacellular
种类有：virus病毒、viroids类病毒、prokarytoes原核生物、fungi真菌、柔膜纲（ex:mite）、立克次体。 

3. 操作室：外在污染源

在组织大量培养下，除了植物本身外，大部分最有可能的污染来源便是来自操作室。依其可能原因分析为：

（1）空气

在操作室中，未过滤空气带有大量的微生物，随者操作人员或植株接触时，而污染培养皿。故在国外对于操作室内空气的清洁度分为四种等级：

ClassⅠ.没有容易培养的微生物，和作物之主要病原菌

Ⅱ.没有容易培养的微生物，和作物特殊病原菌

Ⅲ.没有容易培养的微生物

Ⅳ.未做检测

（2）不完全的灭菌设备或技术

因为使用灭菌不完全的设备或是技术，而导致植株或培养皿的污染，例如：有些酵母菌，可避免酒精消毒，还有一些会产生内孢子，而避免火焰消毒。

（3）人员

在整个操作室内，人员可说是最大的带菌者，其不管在毛发或是衣服等，都隐藏属不清的菌。在进入操作室前，最好能将作业人员清洁处理，然后换上脱鞋，或是将尘土去掉。

（4）细缝的存在
因为若操作室有细缝的存在，则造成外果气体直接流入，使得空气中菌数增加。

（5）操作台上的滤网不干净
因为使用过久，或不当保养，而造成滤网坏掉，而产生更多的污染。

（6）蹒及蓟马的存在
此为珠形网，具有活动能力，能到处跑来跑去。因此常造成散乱的污染。 

4.栽培过程污染
在栽培室，组培瓶外和外界气体交换时，亦会有污染进入。污染机率取决于空气中带菌密度与组培瓶空气交换率。 

二、污染的种类及形式

1. 污染的形成
依据污染的来源，可将污染分为三个形式：

a.由植物内部或病原菌所造成的污染
植物内部或病原菌所造成的污染，所呈现是系统性，及从stageo~stage4中都可发现，而且占有一定的百分比。

b. 在制造时所造成的污染
如因蹒或是空气中的关系造成的污染，其所表现的方式是散乱（random）性非系统性，且不集中于某一地方，占的百分比也不一定，是机率性。

c. 技术上的失误
其呈现方式有一定性，例如由此工作台所生产得植株都被污染，表现为带状性，可用卷标方式来追踪，以进而改善。

2. 污染的来源分类

A、污染的种类，以总体来说可分为下列几种：

a.病毒(virus)－常存在植物内部。
      b.(viroids)常存在植物内部
      c.细菌－在组织培养中又分依其来源和所在地方分类如下：

(a)     phlem-eimited生长于韧皮部 

xylem-eimited生长于木质部

(b)植物病原细菌

(c)空气中存在的细菌，但因植物有伤口，或是营养丰富的地方，可分为植物表面的细菌或植物内部的细菌。

例如：Bacillus spp.可抗热，在不完全灭菌的玻璃器皿中可发现。

(d)菌质体
是一种像细菌的微生物，但是本身没有细胞壁，可以在培养基培养，亦可用特殊的抗生素（四环霉素）抑制其生长。其种类有microplasm与spiroplasm。

(e)真菌

在植物病害中，真菌所引起的病害特别多且严重，且因其会产生孢子，所以会随着空气飘散。一旦落于适当的环境下，一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落，污染整个组织培养瓶。例如常见的酵母菌，其菌落为粉红色，若有其出现，则其污染来源可能来自空气。

(f)蹒或蓟马
此为细小的微生物，具有活动能力，喜欢吃菌丝。在国内使用期限较久的组培场中常出现此问题。

(g)立克次体
目前未清楚其污染方式。 

B、以培养难易区分污染源

1. 在培养基中易培养菌类
细菌，真菌，蹒。

2. 在培养基中不易培养的菌类
病毒，类病毒，立克次体，菌质体。 

在组织培养过程中，常造成污染或是造成威胁的菌类，称为培养菌类。因常为腐生菌，且营养需求不高（随便吃，随便活）所以常造成成本的增加。而且污染后，常使培养基的pH值降低，洋菜无法凝结，而使植物无法生长或是产生有毒物质或副产品，使得植物生长缓慢，或是干脆就在植物上生长。在培养基上不易培养或是不能培养的菌种，就不会造成太大的威胁。 

C、各种菌种其主要传播方式

1. 病毒，类病毒，菌质体－常利用机械或利用有载体传播。

2. 细菌－可经人力，气流或水，及昆虫等传播。

3. 真菌－亦同上，但孢子可经空气传播。

4. 蓟马－同上，具活动力，自由运动，应慎防出现。 

D、依其菌落生长出现的快慢区别

1. 可见的菌落在组织培养中。一些易培养的菌类，其生长特性为快速蔓延整个组培瓶。但此种污染可利用工作人员之视觉观察将之侦测出来将之销毁，对后代植株造成威胁不大。

2. 潜藏的菌落－在组织培养中有些不易培养或是在植物内部寄生或共生的菌类或病原菌，在培养时没有表现出来，但是有存在或只有很微弱的表现，但是未被察觉出来。于是便造成了对后代植株的重大威胁及成本的增加。 

其污染未明显表现出的原因有下列几项：

a在培养基中含有抗生素，则菌类不易生长。.

b.在培养基中，因植物本身的汁液含有某些特殊的成分例如：单宁酸，因此抑制菌类表现。

c.培养基成分不适合其大量表现，可能因营养需求不同。

c. 本身菌类生长方式不同：

例如病毒为绝对寄生菌，无法在一般培养基中培养。

E、依其植物栖息的地方分为：

1. 植物表面栖息的菌类
如：细菌，真菌。

2. 在植物内部共生寄生的菌类：
如：病毒，类病毒，细菌，真菌，菌质体。

3. 在大气中游移的菌种
细菌，真菌，蹒。 

三、污染种类的鉴定方式

1. 针对培养难易菌种鉴定方式

A、针对易培养的菌种：其种类为真菌，细菌

a.就真菌而言，主要是利用显微镜，视其孢子形态、产孢结构、及菌丝有无隔膜、还有细胞壁之形成加以鉴定。目前亦有使用DNA探针加以分析。

b.就细菌而言，则是利用其特殊的生化反应，或是利用选择性的培养基。目前亦有如用fatty acid profiling技术和商业化的test kits加以鉴定。
 
B、不易培养的菌种，如菌质体，病毒，类病毒。

a.就菌质体而言，主要是观察其在培养基上菌落的形态。

b.病毒而言，分析其核酸的组成与例子的外形。
类病毒因没有套膜，以上两种常利用其DNA有同源性而做探针侦测。 

C、病原菌的侦测

利用柯霍氏法来测其病源性。而利用分子诊断，如血清、ELISA、DNA序列、核酸的探针以鉴定种类。 

2. 鉴定菌种常用的方式与应用的微生物种类
 
方法                     目标微生物
  
无种别性
指示培养               所有可培养的细菌
DNA/RNA 萤光染色法         菌质体及有关原核生物
Leaf dip electon microscopy        长条状的病毒，其数目较多者亦适用
电泳                 类病毒
有种别性
ELISA                 细菌及病毒
PALIAS                细菌及病毒
ISEM                  病毒
DNA探针                所有微生物
快速诊断的 kits             细菌
Fatty acid profiling            细菌

3. 一般对细菌的基本测试
a.Gram stain
b.形状
c.游动性
d.催化酵素的测试
e.氧化酵素的测试
f.热稳定性
g.行氧化作用或发酵作用 

四、针对污染源常使用的防治方法

A. 种类
1. 热疗－对病毒较有效但须花费时间。处理时，需6-12星期在30-40℃。
2. 冷疗法－亦对病毒有效。
3. 利用抗生素。
4. 以分生组织，不带病毒等污染源。
5. 利用培养基中高糖，高盐的浓度。
6. 利用抗并毒药物。
7. 营养需求不同。
8. 利用水。
9. 抽样检测。 

B、防治方法之效果讨论

1. 热疗法及冷疗法

对病毒有效，但须花时间处理，例如：热疗法处理时间需花6-12星期在30-40℃。

2. 利用抗生素

这是目前较常用的方法，但是在抗生素加入培养基，其有效浓度常因植物具有半渗透功能，而使浓度无法达到有效浓度。使用抗生素时，需注意下列事项：
（1）要知道抑制的微生物为何，再使用抗生素，及对症下药。
（2）要决定最小抑制浓度，以降低成本。
（3）要确定抗生素不会对植物造成并害或突变。
（4）确定抗生素在培养基上是否有作用。
（5）使用时，常因需要而多种混合或交替使用。
（6）有些抗生素在某些国家是禁止使用，使用前必须做询问此药剂是否合法使用。
使用抗生素的缺点
（1）可能对哺乳类动物有害。
（2）若是使用生长期较长的植物，微生物亦有抗药性产生。
（3）容易错误使用：没有针对微生物而使用各种不同的抗生素。

抗生素的种类                            对象
  
抑制细胞壁合成
Bactracin                  G(+)，杀菌，对抗β-lactams的菌有作用
β-lactams                 G(+)，杀菌，若用10-100倍，则对G(-)有效
Glycopeptides              G(+)，杀菌，但恨贵，不易有抗药性
抑制膜的形成            
plymixins                  对G(-)Psedomonas spp.有效
抑制蛋白质的合成
Ghloramphrnical            杀菌作用，便宜，但对植物有毒害作用
Aminoglycosides            使用对象广泛，对植物有毒害作用，在碱性环境下较有活性可针对G(-)可和盘尼西林(pencillins)一起作用
Macrolides and              对G(+)有静菌作用
Lincosamides
Tetracyclines               为静菌作用，对G(+)、G(-)都可以会刺激酵母菌，植物有害对
核酸抑制物质
Qutnolnes                 杀菌，对 G(+)有效，10-100倍浓度则对G(-)有效，有抗药性产生，可引起过敏反应易
Rifampicin                杀菌，对一些G(+)或G(-)的细菌有作用，但常有抗药性产生
Trimethoprim             对于一些 G(+)或G(-)的细菌有作用，Trimethoprim
Sulphonamides            Sulphonamides两种混合使用有加强的作用
Sulphonamides在碱性环境下较活跃 

3. 分生组织法

主要是针对在植物内部寄主的菌类，如病毒等。因其生长速度无法长到顶芽的分生组织，所以在顶芽的分生组织则无病原菌存在。可以利用此分生组织培养成植株即可避免感染问题。

4. 利用培养基中高盐或高糖的浓度

在培养基中有一些高盐或高糖的浓度可抑制微生物生长，或有单宁酸的存在时也可以达到抑制效果。

5. 利用抗病毒药物

Ribaririn－对于ssRNA病菌有抑制作用，但是价格昂贵。

6. 营养需求不同

因为不同的菌类其营养需求不同，因此可利用选择性培养基可筛选或抑制一些微生物。

7. 利用水淹

利用水将植株清洗或是完全浸没，以避免其上的接种源四处扩散。

8. 抽样检测

对于后代植株的抽样检测，可将污染严重的个体去除。以上这些方法可以综合使用，以建立一个清洁的植株。 

五、污染所造成的结果

1. 生产成本的提高。

2. 对植株造成伤害。

3. 增加接种源及污染的机率。

六、在组织培养过程各个阶段所应注意事项

（1）目前组织培养之流程主要分两种，如下图所示：

在此两种系统中，ModelⅠ和ModelⅡ之比较：
ModelⅠ：先做好一小批产品，再进入量产，此每一单位为一瓶，且自为独立环境，具区隔性，故有污染时所造成的伤害不大。
ModelⅡ：其为大容器系统，一旦有污染，则整批无法避免将会受到污染其培养基多为液体状态。 

（2） 各阶段注意事项

stage0： 建立干净的植株，以利下面阶段的作业进行。只要建立无菌的植株，则污染的来源便只是来自技术上的失误。因此在此阶段要将病株丢除，并且将其具较多污染源的植株去掉。一般会选择较成熟的植株，因其病征易显现找到植株后。分离其菌或病原菌，做系列稀释以决定浓度。

stageⅠ：在stageⅠ的污染可蔓延培养基，故可利用“视觉”将之选出或丢弃，对于潜伏性或是表现微弱的菌种，需作特别的测试，在此阶段，要对一般的微生物作测试及对已知的病原菌作测试，若两种为负便可进入stageⅡ。stageⅡ要把污染的植株去掉，知道病原菌并重复分生组织的培养。

stageⅡ：在此阶段中，只有无菌的植株可繁殖。假设此植株为无菌，则污染源便来自操作室，故要先丢掉污染后，然后再取样抽检。

stageⅢ：如同stageⅡ。

stageⅣ：对后代植株需取样检查。 

七、讨论

目前组培苗污染实验所遇到的问题为不易建立植株的干净度，因此无法确定真正的污染源来自何处，无法对症下药。而且对于菌种的鉴定有很大的困难，因为一般有关植物或是植物病原菌，因为有钱人的资料留下，可叫易鉴定。但是对于目前一般在大气中生存的微生物，其背景资料较少，对于鉴定而言，便较棘手。而且目前商业化的test kites一般都是针对人体或是食品方面。对于可应用于植物的test kites太少。且使用ELISA或分子诊断，则因专一性太强，一旦有别种的微生物出现，则造成了无法侦测到而逸出。 

由上述这些资料可得知在组织培养的过程中，上流的技术会影响到下流的产量，而污染问题常在整个制造过中占有一定比例。对于如何控制污染，亟欲警系统的建立，和建立一个良好的工作环境，训练素质优良的员工，和干净的植株系统为组培业所要努力的方向。