植物组织培养

植物组织培养是把植物的器官、组织乃至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（ IAA ）和 6 –苄基氨基腺嘌呤（ 6 – BA ）的比例，决定了根和芽的分化。

近年来，组织培养作为一种研究技术，已广泛地应用于许多学科中，它不仅对理论研究有重要意义，并已展现了十分广阔的应用前景。

一、原理

植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。早在1957 年Skoog 即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。

二、试剂与仪器设备

1、试剂

乙醇、IAA 或2，4–D 、HgCl ₂（或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ）、MS 培养基

2、仪器设备

培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL），烧杯，量筒，培养皿，棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸。

三、实验步骤

1、 配制培养基

（1）愈伤组织诱导培养基：MS 培养基（蔗糖含量为10 g/L ，2,4–D 含量为2 mg/L ，琼脂10 g/L ）。

（2）试验培养基：在MS 培养基中按表1加入IAA 和6–BA 。

吲哚乙酸先用少量0.1 mol/L NaOH 溶解，6-苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。

                                  表1      试验培养基中IAA 和 6–BA 含量

序号	IAA （ mg/L ）	6-BA （ mg/L ）	相对比值
1	0	2.0
2	0.2	2.0	1:10
3	0.5	2.0	1:4
4	1.0	2.0	1:2
5	2.0	2.0	1:1
6	2.0	1.0	2:1
7	2.0	0.5	4:1
8	2.0	0.2	10:1
9	2.0	0

2、培养基灭菌

将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH 5.8 ，趁热分装于100mL 三角烧瓶中，每瓶约20 mL 。待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃（1kg/cm 2）下灭菌20min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。

3、诱导产生愈伤组织

（1）取健壮的烟草茎数段，每段约5cm 长，于烧杯中用0.1% 氯化汞（升汞）浸泡20 min ，取出用无菌水洗3 ～4 次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌 30 min），用解剖刀切成5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种4 片，接种后扎好瓶口。

（2）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在25 ℃温室中，每星期检查l ～2 次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶，3～4 周后产生愈伤组织。

（3）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放1～2 块，仍培养在25 ℃温室中，每周1～2 次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。