植物组织种丙二醛含量的测定

了解丙二醛(malondialdehyde, MDA )在生物体形成的因素；重点掌握MDA测定的原理和测定方法；进一步熟悉和掌握分光光度计和离心机的使用方法和注意事项。

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化分解的最终产物之一，其含量可以反映膜脂过氧化的程度。同时，MDA在生物体内积累还会对细胞膜造成进一步的伤害，所以MDA的含量可以反映生物体衰老和遭受逆境伤害的程度。

植物组织中的MDA在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA)产生显色反应，反应产物为粉红色的3，5，5-三甲基噁哩2，4-二酮。该物质在532 nm波长下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可与其他物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其他物质反应的影响。在丙二醛含量测定时，同时测定600 nm下 的吸光度，利用532 nm与600 nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。

材料：4种菠菜样品，即室温对照处理的绿色叶片和黄色叶片，高温处理的绿色叶片和黄色叶片。

试剂：0.05 mol · L^-1 pH 7.8磷酸钠缓冲液；石英砂；

5% 三氯乙酸溶液：称取5 g三氯乙酸，先用少量蒸個水溶解，然后定容到100 mL；

0.5% 硫代巴比妥酸溶液：称取0.5 g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100 mL。

器材：分光光度计，离心机,水浴锅，天平，研钵，剪刀，5 mL刻度离心管

10 mL刻度试 管，镣子，5 mL、2 mL、1 mL移液管，冰箱。

植物组织种丙二醛含量的测定的基本过程可分为如下几步：

1. 丙二醛的提取：取5 g样品，加入2 mL预冷的0. 05 mol · L^-1 pH 7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5 mL刻度离心试管中，将研钵用缓冲液洗净.清洗液移入离心管中，最后用缓冲液定容至5 mL。在4 500 r · m^-1条件下离心10 min。上清液即为丙二醛提取液。

2. 丙二醛含量测定：吸取2 mL的提取液于刻度试管中，加入5% 硫代巴比妥酸溶液 3 mL,于沸水浴上加热10 min,迅速冷却。于4500 r · min^-1离心10 min 取上清液于532、 600 nm波长下，以蒸憎水为空白调透光率100%，测定吸光度。

3 .结果计算：

式中以一吸光度；

V₁ —反应液总体积，4 mL；

V一提取液总体积，5 mL；

V₂一反应液中的提取液体积，2 mL；

W一植物样品重量，0.5 g；

1.55X10^-1—丙二醛的微摩尔吸光系数（在1 L溶液中含有1 μmol 丙二醛时的吸光度）。

1. 1%~0. 5% 的三氯乙酸对MDA-TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高。

2. MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制在沸水浴10~15 min。时间太短或太长均会引起532 nm下的光吸收值下降。

3. 如用MDA作为植物衰老指标，首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA反应形成532 nm处的吸收峰。否则只测定600 nm两处A值，计算结果与实际情况不符，测得的高A值是一个假象。

4. 在有糖类物质干扰条件下（如深度衰老时），吸光度的增大，不再是由于脂质过氧化产 物MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改变了提取液成分，不能再用 532 nm、600 nm两处A值计算MDA含量，可测定510、532、560 nm处的A值，用A532 -（A₅₁₀-A₅₆₀ ）/2的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。