彩色免疫金银法（CIGSS）操作指南

1、基本原理

彩色免疫金银法（coloured IGSS, CIGSS）是在IGSS基础上发展起来的一种新方法。其基本原理与彩色显影相似。IGSS染色方法在抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用即被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂相接触立即被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色显色剂由无色变成有色的染料并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以不与组织发生非特异性吸附。

2、操作流程：（以彩色显影人肝组织内HBsAg的操作过程为例）

（1）脱蜡和水化。

（2）0.1%胰蛋白酶37℃10min。

（3）Lugol's碘液5min。

（4）5%硫代硫酸钠1min。

（5）用0.05mol/L pH7.4 TBS振洗5min，两次。

（6）1%卵白蛋白封闭10min。

（7）马抗HBsAg抗体1：1000稀释，37℃1～2h 或4℃过夜。

（8）0.05mol/L pH7.4 TBS振洗5min，两次。

（9）1%卵白蛋白封闭10min。

（10）PAg 1：40，37℃45min。

（11）0.05mol/L pH7.4 TBS振洗5min，两次。

（12）双蒸水洗5min，两次。

（13）物理显影。

（14）自来水冲洗。

（15）双蒸水洗5min，两次。

（16）2%铁氰化钾和1%溴化钾，1min。

（17）双蒸水冲洗。

（18）彩色显影（α-萘酚或菲尼酮）2min。

（19）双蒸水冲洗。

（20）2%铁氰化钾和1%溴化钾，1min。

（21）2%铁硫代酸钠和1%亚硫酸钠，5min。

（22）流水冲洗。

（23）如需要可用苏木素复染。

（24）缓冲甘油封固，观察。

3、CIGSS优点

（1）阳性结果比黑色更鲜明；

（2）可以使弱信号得到放大；

（3）消除IGSS背景染色；

（4）信号/背景比值高；

（5）是开展免疫金银双标技术的新途径。光镜下见HBsAg阳性物质呈鲜艳的蓝色（α-萘酚为成色剂）或呈绿色（菲尼酮为成色剂）。背景干净，阳性结果清楚。

4、彩色显影背景过染的处理方法

彩色免疫金银法，在胶体金技术中是一个很大的突破，它的优点是结果鲜明，对比度好，但是在彩色显影过程中时间过长，背景可有一些着色，彩色显影的时间控制很重要。一旦过染可用以下方法处理：

（1）纯酒精滴到切片上3～5s，立即冲掉，水洗，充分洗去酒精，如果洗不彻底，易造成阳性结果褪色。

（2）75%的酒精滴到切片上1min，立即冲掉，褪色不能时间过长，过长后阳性结果全部褪掉。