彩色显带实验

一、标本制备和老化

1.用甲醇/冰乙酸固定的方法制备细胞悬液。

2.滴一滴细胞悬液于载玻片上，在染色体铺展所需的适宜温度（25°C) 和湿度（45%?50%) 条件下干燥标本。

3.用相差显微镜检测标本片的质量，在玻片上画出染色体分散良好或感兴趣的中期染色体区域。

4.在 60°C 烤箱中放置 2 h，老化当天制备的标本；或在 60°C 烤箱中烤 1h 老化室温过夜的片龄 1d 的标本片。将老化后的标本置于室温下，以备进行 RxFISH 的后续步骤。

5.标本在室温下的 70%、85% 和 100% 系列乙醇中各脱水 2 min，空气干燥。

二、变性和杂交用溶液的配制

1.配制 70% 乙醇，放于一 20°C 冰箱中。

2.配制 50 mL70% 甲酰胺/2XSSC(pH7.5) 放在 72°C 水浴锅中。

3.配制 70%、85% 和 100% 乙醇，室温保存。

4.准备湿盒，37°C 预热。

三、探针变性

1.将装有 RxFISH 探针的离心管在 37°C 水浴中预热 5 min。

2.轻轻混匀，稍离心。

3.用无菌枪头按每张标本 IOyL 的探针量移液到 0.5 mL 离心管，盖好管盖。

4.将不用的 RxFISH 探针放回一 20°C。

5.65°C 水浴中变性 RxFISH 探针 lOmin。

6.将变性过的探针于 37°C 水浴中放置 IOmin?2 h 备用。

四、标本变性

1.确保染色缸内的 70% 甲酰胺/2XSSC 溶液温度为理想的 72°C(见注释 1 和 2)。

2.在 70% 甲酰胺/2XSSC 溶液中变性标本（不超过 4 张）1.5 min(见注释 3)。

3.迅速将变性标本于一 20°C 冰冷的 70% 乙醇中淬灭（见注释 4)。

4.将标本依次在室温条件下的 70%、85% 和 100% 系列乙醇中各脱水 2 min，空气干燥。

五、杂交

1.降低环境亮度，避免 RxFISH 探针光漂白（见注释 5)。

2.取 10uL 变性探针混合物加在标本片上画出的杂交区域（含有分散良好的染色体或感兴趣的中期分裂相）。

3.缓慢盖上 25 mmX25 mm 盖玻片，避免产生气泡。

4.让探针溶液铺展到盖玻片的边缘，轻扣盖片，在不移动盖片的情况下排除气泡。

5.用橡皮泥封片。

6.37°C 湿盒中孵育 48 h(见注释 6)。

六、配制杂交后步骤所需溶液

1.配制 150 mL2XSSC 溶液（pH7.0)，分装在 3 个染色缸中，放在 45°C 水浴锅中（见注释 7)。

2.配制 IOOmL50% 甲酰胺/0.5XSSC 溶液（pH7.0)，分装在 2 个染色缸中，放在 45°C 水浴锅中。

3.分装 50 mLpH7.5 的 4：XTween 溶液（500 mL4XSSC 和 0.25 mLTween-20 储存液）在 1 个染色缸中，放在 45°C 水浴锅中。

七、杂交后洗脱

1.用镊子小心除去橡皮泥，将标本放入第一缸的 2XSSC 中 45°C 孵育 5 min，滑落盖玻片（见注释 8~10)。

2.在 50% 甲酰胺/0.5XSSC 溶液中洗片 5 min，将标本转到下一缸同样溶液中，重复洗片 5 min。

3.在 2\83(^溶液中洗标本 51^11，将标本转到下一缸 2\38(：溶液中洗 5 min04. 将标本转到 4XTween 溶液中，45°C 孵育 IOmin。

八、抗体检测步骤（可选择的）

1.在上述的 3.7 中的第二次甲酰胺洗片的同时，室温条件下 14OOOg 离心两种检测 FITC 的抗体 lOmin，只用上清进行下面的实验。

2.在小离心管中加入 1ul 兔抗 FITC 抗体和 199uL 4 X Tween 溶液，轻轻混匀稀释液。室温避光孵育 10 min。

3.甩去标本上的多余液体。

4.向每张标本片加 200ul 兔抗 FITC 抗体 1:200 稀释液，37℃湿盒中孵育 30 min。

5.将水浴锅温度由 45°C 降至 42°C，预热装有 4XTween 溶液的 50 mL 染色缸，同时预热 6 次洗脱所需的 250 mL45XTween 溶液。

6.检查以确保水浴锅和 4XTween 溶液温度为 42°C。然后移去标本上的盖片，洗片 5 min。倒掉溶液，加入新鲜预热的 4XTween 溶液，再洗片 5 min。重复一次该步实验。

7.在洗脱的过程中，向另一离心管中加入 2uL FITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体和 198juL4XTween 溶液，轻轻混勻稀释液。室温避光孵育 lOmin。

8.甩去标本上的多余液体。

9.向每张标本上加 20(^LFITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体 1:100 稀释液，37°C 湿盒中孵育 30 min。

10.检查水浴锅和 4XTween 溶液温度为 42°C，然后洗片 3 次，每次 5 min。

九、DAPI 复染

将 10UL 复染剂和抗淬灭剂溶液加到标本上，并用盖玻片（22 mmX22 mm) 封片（见注释 11)。

十、图像捕获和分析

1.打开计算机，在研究菜单下选择 RxFISH 软件。打开软件后，选择捕获界面。开始图像捕获前，将滤色块轮设定到适合的顺序。捕获的探针信号保存在原始图像图层中，组合得到最终图像。Rx_Cy5 信号最先捕获，随后依次是 Rx-Cy3、Rx-FITC 和 Rx-DAPI。

2.用 FITC 进行中期扫描。FITC 荧光信号不容易淬灭，所有的分析过程可以保持明亮。当找到一个中期后，在 100X 油镜头下聚焦，然后选择 Rx-Cy5。

3.肉眼无法观察到 Rx-Cy5, 需要依赖计算机图像来了解详细信息。当曝光设定为 5s 时，应能够在黑暗背景下检测到微弱的白色图像。缓慢聚焦增加清晰度，因为在照相机和软件之间存在时间延迟。调节明暗直至得到好的对比度（约 90% 准确度）。针对不同的图像设置应略微调整。

4.点击「Live」按钮，滤色块轮将自动转到列表中的下一个荧光滤色块。大多数情况下其他的荧光信号曝光 2s 即可。一旦得到清晰带型的图像时，点击「Capture」按钮。

5.完成所有 4 个突光信号的捕获后，选择标记有「RxFISH Image Capture」的界面。在选择的界面内，完成整套图像的合成。保存所有的图像，即使有提示也不要删除，这些图像在分析中非常有用。

6.激活「Analysis」菜单，选择你想要分析的细胞。选择「Loadcell」将显示多色显带的染色体（见注释 12)。在「AnalysisCustomize」菜单下，RxFISH 图像也可显示为 DAPI 反转图像，可帮助识别染色体。「AnalysisProfile」工具用于显示每条染色体强度曲线。

7.用「Analysis」命令可分开染色体，只要一完成染色体分离，就可用「Classifier」和「Auto」命令产生细胞的核型。

注释

1.变性步骤是操作程序中非常关键的。变性时间和温度由标本的类型和片龄决定。每个实验者应根据自己需要确定适宜的温度和时间。一般在 70~75°C 温度范围和 1.5?2 min 时间范围内能够得到好的结果。

2.整个实验过程中，应在使用前检查每个染色缸中的液体温度。通常染色缸中的液体温度比水浴锅的温度至少低 TC。

3.每张室温标本放入 72℃甲酰胺中将降低 70% 甲酰胺/2 X SSC的溶液温度 0.5~1°C; 如果一次放人超过 4 张标本，70% 甲酰胺/2XSSC 的温度将不足以进行变性。

4.如果处理超过 4 张标本片，70% 甲酰胺/2XSSC 和第一缸 70% 乙醇必须调回它们的初始温度，即分别为 72°C 和一 20°C。

5.Cy5 荧光染料在红外波长范围内非常敏感，易被白光激发，因此在图像捕获过程中，应首先进行捕获，因为它将第一个淬灭掉的荧光。

6.标本在 37°C 湿盒中杂交 12~96 h。探针杂交时间不要少于 12 h，因为这会使信号強度将大大降低。杂交 48 h 能够得到稳定的强信号，这是成功捕获图像所必需的。可根据各实验室的经验减少杂交时间。

7.为确保结果的质量，每天倒掉使用过的溶液。变性步骤中用的溶液不能储存起来用于杂交后洗脱步骤。

8.杂交后洗脱的步骤应在弱光的条件下完成，避免直接标记突光染料（Cy5 和 Cy3) 光漂白。

9.在杂交后的所有实验步骤中，标本片不能干掉。

10.如果盖片不能从载片上滑下来，将标本片放于 2XSSC 中再次洗脱 5 min，再检查盖片是否滑落。

11.标本片在一 20°C 避光保存，以备拍照。

12.如果染色体彩色带型颜色比较淡，不够明亮，在比较暗的设置下（减少曝光时间）重新捕捉图像。在图像捕捉前调好焦距，缩短曝光时间以减少延迟。

照相机有个芯片收集荧光，然后将信息传递到计算机中，这就是为什么出现延迟的原因。DAPI 图像不应该太暗，它为其他荧光颜色提供背景。如果 DAPI 图像不够亮，染色体看起来边缘参差不齐。由于同样的原因，调节好 DAPI 图像的焦距是很有必要的