免疫电泳实验技术

（一）原理

免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。

该方法可以用来研究：①抗原和抗体的相对应性；②测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率；③根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其它特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质；④鉴定抗原或抗体的纯度。

（二）试剂与器材

同琼脂平板电泳。

（三）操作方法

1．在玻璃板的中央放置一小玻棒（d=2mm~3mm），然后用0.05mol/l pH8.6巴比妥缓冲液配制1％琼脂，制成琼脂板，板厚2mm.。

2．在玻棒的两侧，板中央或1/3处，距玻棒4mm～8mm各打直径3mm～6mm的孔。

3．在孔内加满血清。

4．将玻璃板置电泳槽上进行电泳。电流为2mA/cm～3mA/cm（或电压3V/cm～6V/cm），电泳时间4h～6h。

5．停止电泳，用小刀片在玻璃板两侧切开，取出玻璃棒，加抗血清样品。

6．于湿盒内37℃（或常温）扩散24h，取出观察。

7．于生理盐水中浸泡24h，中间换液数次，取出后，加0.05％氨基黑染色5min～10min，然后以1mol/L冰醋酸脱色至背景无色为止。

8．制膜、观察、保存标本。

（四）免疫电泳结果分析

1．常见的沉淀弧 由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，而相应的抗体呈直线扩散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常见的弧形如下：①交叉弧：表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不同；②平行弧：表示两个不同的抗原成分，它们的迁移率相同，但扩散率不同；③加宽弧：一般是由于抗原过量所致；④分枝弧：一般是由于抗体过量；⑤沉淀线中间逐渐加宽并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处形成；⑥其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。

2．沉淀弧的曲度 匀质性的物质具有明确的迁移率，能生成曲度较大的沉淀弧。反之有较宽迁移范围的物质，其沉淀弧曲度较小。

3．沉淀的清晰度 沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关，也与抗体的来源有关。抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗体的特点是形成沉淀线宽而淡，抗体过量对沉淀线影响较小，而抗原过量，沉淀线发生部分溶解。马抗血清所形成的沉淀线致密、清晰，抗原或抗体过量时，复合物沉淀溶解、消失，而且产生继发性的非特异性沉淀。因此使用抗原抗体时，一定要找好适当的比例。

4．沉淀弧的位置 高分子量的物质扩散慢，所形成的沉淀线离抗原孔较近；而分子量较小的物质，扩散速度快，沉淀弧离抗体槽近一些。抗原浓度高沉淀弧偏近抗体槽，反之，抗体浓度过高，沉淀弧偏近抗原孔。

（五）注意事项

1．免疫电泳分析法的成功与否，主要取决于抗血清的质量。抗血清中必须含有足够的抗体，才能同被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。

2．抗血清虽然含有对所有抗原物质的相应抗体，但抗体效价有高有低，因此要适当考虑抗原孔径的大小和抗体槽的距离。

3．免疫电泳要求分析的物质一方为抗原，另一方为沉淀反应性抗体。因此没有抗原性的物质或抗原性差的物质、非沉淀反应性抗体，均不能用免疫电泳进行分析。