PCR技术系列十五：个体配子DNA序列的PCR分析

高等生物遗传图谱的构建依赖于选择性杂交后代的分析或者通过家系分析法来计 算连锁关系。对人类而言仅后者是可行的。使用长度多态性限制片段（RFLPS）在构 建人连锁图谱方面已取得长足的进步。为了对带有与已知表现型相关的RFLP标记的基 因进行定位，首先得建立间隔约10CM的遗传标记束（平均1CM等于1％重组），这样没 有基因离标记RFLP的距离会超过5CM.可靠的统计表明家系分析能够检测的遗传间距 精确到1cM(1cM相当于1000kb的DNA.分析更小的遗间距需要检测家族内大量的个体， 而这实际上是行不通的。

最近发展了一种不依赖遗传交叉或家系分析的方法检测遗传标记间的重组频率。 具体方法是直接决定配子(精子)的基因型是亲本型还是重组型。这通过确定两个等位 基因中哪一个存在于双杂合男性精子上的两个基因座点其中之一来完成。根据上述方 法确定的重组精子的数量被总检测精子数除就可估计出重组频率。已知聚合酶反应在 体外扩增基因能够使DNA扩增109倍，因此该技术有可能分析精子中单分子靶DNA.以 这种方式研究数千个人精子就有可能构建比家系分析要精确得多的遗传图谱。该方法 提供了一个独物的手段来研究许多现在被认为是不能解决的人类遗传学领域的难题。

用PCR确定精子类型的原理

从人类家系分析的观点来看，每个个体都是亲本减数分裂产生的单个产物的融合 体。双亲以及后代体细胞DNA的研究加上适当的统计学方法可推知形成合子的减数分 裂产物的重组或非重组的性质，同时可以估计重组在减数分裂中所占的比例。我们研 究遗传重组的方法与上述的不同，它通过分析减数分裂产物本身的DNA来决定减数分 裂发生重组的比率。每个男性一生中可产生大量的减数分裂产物精子，从而提供了进 行遗传分析取之不尽的实验材料。

假设一个男性杂合子有两个连锁基因座。每一个基因座的多态性差异在于AT-AT 或GC-GC)要么是重组型(AT-GC或GC-AT)。重组类型出现的频率将取决于两个基因座彼 此间的遗传间距。通过检测某一个体的大量精子，可精确地计算出四种精子类型出现 的频率。该技术存在的困难在于确定减数分裂前细胞中的每个基因座上存在的两种等 位基因中的哪一个进入单个精子。常规的分子生物学技术没有足够高的灵敏度分析精 子染色体DNA的单个分子。

PCR扩增每个基因座的多态性区域是分析精子的第一步。两个基因座用两组引 物，同时引物必须位于多态性区域的边侧。当精子两个靶序列经PCR扩增，就确定了 每个基因座的等位基因成份。人工合成的寡核苷酸探针可识别等位基因小到仅发生单 个碱基置换的实验方法已得到改进，这些等位基因牧场划的寡聚物（ASO）探针第一 次应用是将人正常β珠蛋白基因中的正常βA等位基因与镰刀形红细胞（βA）的突变 区分开来。本方法检测等位基因需要人工合成的小片段寡核苷酸（典型的长19bp)。 每个寡核苷酸与一个等位基因完全互补而与另一个等位基因通常只有一个碱基的差 别。同位素标记的寡核苷酸分别与待检测扩增的DNA样品杂交。在适当的杂交条件 下，只有样品中的序列完全互补时，寡核苷酸可形成稳定的双螺旋。例如，精子的 PCR产物用四种ASO探针分析。有一对ASO分别将基因座1的两个等位基因区别开，另一 对将基因座2的两个等位基因区别开。实际上，预期两个ASO中只有一个与某一个减数 分裂产物杂交，可以确定每个检测的精子对于所研究的染色体而言实际上是单倍体。

人单倍体细胞有1.5-5X10-24摩尔单一DNA序列。根据以前的实验结果，我们知道 活性达5μCI/微微摩尔的同位素标记就能够在不到一天的时间内检测出1毫微微摩尔 （10-15/10-24）。即使以较低的平均扩增效率，大约经50个扩增循环便可完成。

单个细胞的PCR分析

单个二倍体细胞

在分析单精子以前，Li等人对个体二倍体细胞内的β珠蛋白基因进行过研究。两 个组织培养细胞株用于这些实验。其中一个纯合是镰刀型细胞密码子6（βS）发生突 变，另一个纯合子则来源于正常的βB等位基因。扩增含有密码子6的β珠蛋白片段的 引物，及能够区别这两个特异的等位基因的寡核苷酸探针（ASO）已经报道过。βA纯 事细胞和βB纯合细胞和βS纯合细胞在同一组织培养瓶中共同培养数天。将用相差显 微镜观察到的混合培养的单个细胞转入溥塑料胡管内。分别将单个细胞转入含裂解液 的PCR管中，保温后，加入PCR缓冲液，缓中有四种dDNP．Taq DNA聚合酶和扩增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分钟变性靶DNA，然后根据已发表方法的改进方案进行 50全循环的扩增。通过打点杂交，等量的扩增产物打点于尼龙膜后，扩增产物分别与 βA和βS的探针杂交。所分析的37个细胞中，84％细胞只与βA和βS探针杂交，杂交 强弱各不相同；19个与βA探针。12个与βS探针杂交。12个以水作空白对照的反应管 中瓜呈阴性，它表明忽略不记DNA的污染。没有与两种探针都杂交的样品，它暗示转 入到反应管中的单个细胞，而且组织培养基中存在的从βA或βS细胞中裂解出来的 DNA并未吸附在单个细胞上。

单个细胞的PCR扩增产生的β珠蛋白基因的数量通过与已知携带蛋白基因的质粒 DNA样品在杂交模上的杂交信号的强度进行比较确定。据估计PCR反应开始时，一个二 倍体细胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩尔）在5－500毫微微摩尔之间，每个PCR循环以 平均效率65％计算，经50个循环后它的DNA相当于平均扩增了7.6×1010倍。考虑到扩 增的程度之大，因此排除任何可能的污染对于单个细胞的分析十分关键。

单精子的分析

Li等人随后对位于染色体19编码LDL受体(LDLr)的基因的杂合体单精子的基因型 进行分析。根据已知的DNA序列，他们用PCR和ASO分析检测LDLr的RFLP.PCR的引物和 探针以前已有报道。单个精子的分离与二倍体细胞的分离方法一样，精液经蔗糖梯度 离心得到纯化的精子，精子于－20℃可保藏8个月。显微镜下将单个精子吸入毛细塑 料针管内，然后转入试管内以作裂解。裂解的方法与发表的方法冲液(50mM KCL， 10mM Tris.HCL，pH8.3，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明胶），0.05mg/ml蛋白酶K，20mM DTT和1.7μM SDS.37℃保温1小时，加入PCR反应物以前，样品加热到85℃。PCR扩 增。对80个精子LDLr基因型已作过分析。55%的雄配子显示出杂交信号。22个携带 LDLr等位基因，21个携带LDLr2基因。仅一个与两种探针杂交都呈阳性。16支对照反 应管中加入所有反应试剂但没有精子，结果无杂交信号出现。两个扩增的等位基因的 分布遵循Mendel独立分离定理，它表明PCR反应以单个减数分裂产物为起始，无污染 的二倍体DNA存在。

Li等人随后又对进行重组研究十分关键的单精子的两个不同基因座的DNA序列进 行扩增。供体雄配子的第六条染色体上的HLAAQα基因座及第十九条染色体上的LDLR 基因是杂合的。最初想在LDLR和DQα引物存在的条件下同时扩增两个基因座的全序列 的努力未能成功。取而代之，在两对引物存在时，先扩增20个循环，经这种最初扩增 以后，将1／50反应混合物加入试管内，用只含HLA引物的PCR缓冲液稀释，另一份同 等量的反应混合物经只含DLDR引物的PCR缓冲稀释，再进行45个扩增循环以后，用第 二次反应产物的一部分与具有等位基因位点特异的两个ASO杂交。123个样品（85％） 有杂交信号。剩下的27个样品无扩增位点。123个样品中有9个至少发现在两基因座其 中之一有两个等位基因，而对这些样品未作进一步的分析。这些样品中可能有不同基 因型的两种精子，而不是由于减数分裂连锁造成的。因为最近细胞学有关人精子的研 究结果表明单个染色体的平均连锁频率在0.1％水平，远远低于所观察到的频率。

在剩下的114个精子中，LDLR基因座有96个已经定型，其中45个为LDLRL、51个为 LDLR2.两等位基因的比率理论值为1：1（平方差＝0.375，0.75>p>0.5ldf)88个的 DQα等位基因的分离处于具有统计学意义的临界值（平方差＝3.68，0.1>P>0.05， ldf)。上述结果表明：1）统计上的不稳定性，2）由于该基因座具有大量的多态性， PCR引物与供体DQαDNA序列之间的错配导致两个DQα等位基因不均等扩增，或3）一 些异常的遗传现象如异常分离。

114个精子中有70个（61％）在两个基因座可见到杂交点。染色体6和染色体19的 独立分离应该出现同频率的四种可能的配子：DQA1，LDLrl;DQA1，LDLr2;DQA2， LDLfrl;DQA2，LDLr2.Li等人观察的结果每种类型分别为21，18，14和17个，这些结 果与所预料的分布无明显差异（平方差＝1.43，0.75>P>0.5，3df）。结果表明可以 同时在两个不同的遗传位点可靠而有效地确定单个精子的基因型。

在有一个杂交信号的114个杂交样品中，18个有两个DQα等位的基因中的一个， 但LDLR产物未能检测到。26个精子有两LDLR等位基因中的一个，但没有扩增HLA基因 座。由于已知连锁不大可能扩增，因此在这些精子中被研究的这两个染色体有一个是 缺对的（缺对染色体）。

LDLR和DQα基因座扩增的相对频率几乎是相等的。141个样品中88个扩增DQα。 96个扩增LDLR.因此检测DQα和LDLR扩增产物的可能性分别为62％和68％。上述结果 仅为估计值，因为实际上不能够确定141个样品都只含有单个精子。

但可用下列数据估计样品的预期频率：1）两个基因座上的单等位基因的扩增， 2）仅一个位点的扩增，或3）假设每个基因座的扩增是独立进行的，没有基因座笪到 扩增。结果表明69个精子的两个基因座的单等位基因被扩增了，45个只有单个基因座 的单等位基因进行了扩增，27个无基因座扩增。当观察的实验结果与独立扩增的频率 相比较时，结果具有很高的统计学意义（方差＝13.0，P>0.995，2df）。其余的精子 则只有两个基因座的扩增或无基因座扩增，以及远低于预期的两个基因座中单一位点 扩增。结果与裂解的雄配子适宜于两个基因座的扩增或未裂解的精子不能够进行两个 基因认的扩增相一致。因此，如果样品裂均匀，两个基因座的扩增就可能不是独立进 行的。因此，一个靶DNA分子同PCR反应物的亲和性与其它靶DNA分子的亲和性成正相 关性。可以通过改进裂解过程进而增加靶DNA的亲和性来提高单精子的扩增率。

构建遗传图谱

三位点杂交。在DNA水平上能够对单个精子分型将会提供一条新的途径来决定DNA 多态性的物理顺序，而这些顺序的连接是如此地紧密（少于1％重组）以致于用家系 分析的方法是无法确寂的。在随机多态性与致病基因座紧密连锁的情况下该方法特别 有意义。由于该方法能够检测大量的减数分裂产物，即使紧密连锁的多态性也能够通 过三点杂交来排序。这类精细的结构图谱可能在导致疾病的基因座的定位方面具有十 分重要的价值。当然，由于精子并不具有疾病的表现型，不能直接用该方法对一个未 知的疾病基因座多态性进行与DNA多态性相关的图谱定位。根据实验遗传学的经典方 法能够用三点杂交法来推知染色体上的遗传标记的线型排列。假设一个男性是三因子 杂合体，这3个因子在一个染色体上三个紧密连锁的基因座A，B，C上，其相对应的等 位基因区段为a，b，c，且三个基因座的顺序未知。用单精子定型的方法可推知这些 遗传标记的相位。这是因为对于紧密连锁的多态性，最常见的精子类型是非重组的。 根据在八种可能的减数分裂产物中所能观察到的两种最少的类型，就能决定它的顺 序。于是，如果ABC和abc为最常见的类型，那么这些类型为非重组的。如果为ABc， 与此相对的等位基因abC、AbC和aBc的数量居第二，aBC和Abc最少见，那么后两种减 数分裂产物可预期为双交换所致。如果基因座A位于B和C之间（BAC和CAB），与此相 关的频率就是所预期的结果，于是就可以确定基因的顺序。

Michael Boehnke（密执安大学）根据精子三点杂交的结果已设计出一个卓有成 效的方法来决定基因的顺序。Boehnke的计算表明如果相邻遗传标记的间距低至0.5% 的重组，只需对少到600个配子的分析就能够精确地决定三个基因座的次序。我们要 指出，即使同种标记的完全重组频率在男性和女性之间也有所不同，但该方法确定基 因座的次序对“假象”对这种研究的分辩率无绝对影响，在扩增过程中三对引物同时存 在的条件下，扩增的效率也不会受到影响。最近已有报道使用大量的基因组DNA（与 单个精子相对）可同时扩增多至七个独立的片段。在单精子的扩增过程中同时用5对 引物，结果表明特异的靶DNA以高效率扩增，没有由于另外四个基因座的同时扩增而 受到影响。

多态性标记的选择。为了使多态性在用PCR对精子分型中有用，一定得知道位于 多态性位点两侧的序列。每一侧的已知序列不必超过20－30BP，这已为PCR引物的选 择提供了回旋的余地。不幸地是许多具有RFLP的cDNA和基因组克隆的本身无多态性位 点，因此需要进行额外的克隆和序列分析以使它有用于PCR分析。除了要知道用作引 物的序列，通常不对RFLP进行大范围的分析来揭示核苷酸的替代情况。在有些情况 下，PCR产物可用限制性内切酶酶解直接分析RFLP，尽管在单个细胞的实验中我们常 常看到经EB染色后出现的多条带干扰了研究对象。此外，大多数样品进行限制性酶解 以及凝胶电泳（可能是Southern印迹杂交）将会比打点杂交要费力得多。

以连续重复序列或VNTR的不同数目为基础的RFLP，它的特殊形式在常规的基因图 谱的研究方面十分重要。如果能得到重复单位的基因族两侧的20－30BP的DNA序列， 经PCR、凝胶电泳、EB染色就有可能区别等位基因。在DNA基因组研究方面，最近已有 对经PCR扩增的VNTR进行分析的报道。如果有可能消除单个细胞扩增实验出现的多条 带，VNTR多态性就能够用于精子分型的研究。

是将已知RFLP转变成可用PCR分型的标记更为有效还是设计快速检测多态性的技 术更容易适合于PCR分析目前仍不清楚。当然，有许多新方法与PCR结合用来检测多态 性。Leonard Lerman的变性梯度凝胶电泳法（DGGE）可成功地检测出单个碱基的突 变，该方法使用GC发夹或者用经多个限制性酶解的改进DGGE可分析PCR产物。PCR产物 中的核苷酸置换也可以用RNaseA错配分析法来分析。一旦用上述方法检测出了多态性 时，它的位置以及该闰点附近的序列就不难确定了，这样也为ASO探针的合成提供了 必要的数据。运用这些新方法，可从已经过Southrn杂交和图谱分析检测的RFLP克隆 中发现新的多态性。这可能在加速将RFLP转变为PCR分析以及对与致基因座紧密连锁 的RFLP进行定位等方面具有重要的意义。

对常规图谱分析的影响。能够确定单个精子的基因型对用家系法对常规基因图谱 进行分析具有重大的影响。当双亲的遗传标记的相位已知时，就可获取最大限度的有 关家庭研究的情况，而这方面的情况常常是无法获得的。

用单个精子的定型法，通过观察哪一类精子最多就能容易地确定父亲的相位。当 遗传标紧密连锁时，可确定非重组染色体，便也确定了标记的相位。

研究重组与物理间距之间的关系

能够对大量减数分裂产物分裂的另一大好处是将有可能对遗传标记在物理意义上 非常靠近的重级频率进行精确的定位。结合大片段DNA和染色体凝胶电泳的方法，有 可能测得精确物理距离已知的遗传标记之间的重组频率。这就能够对染色体特异区域 的重组频率和物理距离之间的关系进行比较，这些特异区域的重组平均值是常规采用 的每百万个碱基对发生1％重组。

能够检测物理间距很短的重组将在重组热点垢研究方面特别有用。根据大量的不 平衡连锁的数据，人的重组热点存在于β血红蛋白编码区域、胰岛素基因座以及免疫 球蛋白的重链区域。染色体X和Y的假常染色体区域的重组率比1％／1000KB的平均重 组率高出20倍。在一个长的DNA片段内通过家系分析来确定特殊的热点区域将是非常 艰巨的任务。很明显，任何能够估计出小DNA片段之间可能发生重组的技术将对了解 重组增强的分子机制提供有价值的资料，而且同时可能有助于对重组过程本身认识。

其它应用

由于有可能从单个个体中获取具有统计意义的重组频率数据，因此同时也应该能 够确定不同男性的相同染色体间隔的重组率是相同还是不同以及是否特定间隔的重组 率随年龄的变化而变化。从而能够为遗传学的研究提供有价值的资料。

不能够进行大量繁殖或繁殖周期很长的生物体，单个精子分型是构建这些生物体 的遗体图谱唯一实际可行的方法。这或许对研究灵长类如黑猩猩等具有特别重要的意 义，因为物理图谱和单精子重组的研究可能为我们提供有关重组进化的知识，以及由 重组而产生的变异在人类进化过程中所起的作用。

非精子单细胞DNA序列的研究使得有可能研究适涉到在DNA重排或其它遗传改变的 发育过程中细胞与细胞之间的变异，该方法同样具有一定的重要性。同样有可能对移 植前的体外受精胚单细胞进行产前诊断。

总之，单个精子或二倍体细胞的DNA序列分析能够提供独特的方法，不仅仅解决 人类遗传学出现的难题，而且能够解决生物学其它领域出现的难题。