用基因组DNA进行PCR怎么设计引物呢?手上没有DNA全序列，只有mRNA序列，该怎么办呢？

只能反向设计，就是以mrna为模版设计。

先找到基因的mrnax序列。

引物设计参数：

a引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。

b引物退火温度一般在58度，不同软件tm使用不同的算法，primer3，primer5，primer6，primer

express等一般可以设置在55-58度，beacon design可以设置在65左右。

c gc含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。

d产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不好区分，超过200bp可能会影响pcr扩增。

e软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。

f引物设计好以后，在ncbi上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。

您可以通过利用mRNA序列和参考基因组序列之间的比对，来确定目标基因的外显子和内含子的序列和位置，以便设计引物。

具体的步骤如下：

获取您感兴趣的基因的mRNA序列，并使用NCBI Blast等在线工具将其比对到参考基因组上。

根据比对结果，找到目标基因在参考基因组上的位置，以及外显子和内含子的位置。比对结果将会给出mRNA序列上的外显子边界和外显子序列，从而可以确定外显子的位置和序列。在比对结果中，内含子区域将会是两个相邻的外显子之间的空白区域。

根据外显子和内含子的序列和位置，设计合适的引物。对于外显子区域，您可以在外显子序列上设计引物；对于内含子区域，您可以设计跨越内含子的引物，以扩增出包含内含子的片段。

需要注意的是，基因组DNA序列中存在单倍体和双倍体，以及SNP等多样性。因此，需要确保引物在不同个体中的特异性。此外，在设计引物时，还需要考虑引物的长度、Tm值、互补性等因素，以确保引物的特异性和扩增效率。如果您缺少完整的参考基因组序列，也可以使用多序列比对方法，如BLAT、CLUSTALW等，来确定目标基因的外显子和内含子的序列和位置。

比对mRNA序列，找出是哪个基因，接着从NCBI上搜索这个基因中，下载其序列，设计引物