感受态细胞的制备实验技术

互联网2008-07-08

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实验目的

为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。

制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

本次实验的目的就是增加质粒的数量。

同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。

实验原理及过程

	实验步骤	实验原理
1	挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。	让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。
2	取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约2.5小时）。	减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。
3	取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）	使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。
4	菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl₂ 中，轻吹，4℃ 30min，4000rpm离心5min弃上清。生物秀实验频道 www.bbioo.com	细菌处于00C，CaCl₂ 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA ），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）
5	菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl₂ 中，轻吹，用于转化。	除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）
6	取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL，加入2 uL无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL，加入2 uL阴性对照	第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl₂ 溶液和pET-21a质粒未被污染。冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。
7	热激 42oC，90s	在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。
8	冰浴2 min
9	加入800 uL 无抗生素的 LB，37℃复苏1h	用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。
10	取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板，将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。	这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。因为抗生素高温易失活，所以应等到LB600C时（热而不烫），加入抗生素。

实验结果及分析

在本次试验中，所有的平皿都没有长出菌。原因可能是菌因为在-200C下长期培养，细胞活力低下，转化效率低。也有可能是因为涂板时，因为菌沉降到小指管的底部，而我们只吸出了上层的清液。