提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

PCR与RT-PCR技术

互联网

1903


PCR基础

聚合酶链式反应(PCR)过程利用模板变性,引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程,因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般,经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分(表1)。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA;由 RNA 转化得到的cDNA;或未经纯化的粗制生物样品,如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增,但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液,三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点(Tm),忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。

 

表1. 反应成分
Component Final Concentration
Template 10^4-10^6 copies of DNA template
Primer 1 0.1-0.5µM
Primer 2 0.1-0.5µM
10X Reaction buffer 1X
Magnesium 1.0-3.0mM
dNTP mix 200 mM each dNTP
Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction

RT-PCR基础

RT-PCR将以 RNA 为模板的cDNA合成同PCR结合在一起,提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的 RNA 分析技术,更灵敏,更易于操作。
RT-PCR的模板可以为总 RNA 或poly(A) 选择性 RNA 。逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中,逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下,在一只管中顺次进行。


图1. RT-PCR概图

 

 

增加RT-PCR灵敏度

分离高质量 RNA

成功的cDNA合成来自高质量的 RNA 。高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。 RNA 的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的 RNA 纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。Trizol试剂法(见下图)将一步法加以提高,可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解 RNA 。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取 RNA

 

TRIzol®试剂步骤略图
 

一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A) RNA 。不管起始模板是总 RNA 还是poly(A) RNA ,都可以检测到扩增结果(图2)。另外,分离poly(A) RNA 会导致样品间m RNA 丰度的波动变化,从而使信息的检出和定量产生偏差。然而,当分析稀有m RNA 时,poly(A) RNA 会增加检测的灵敏度。

 

 
图2.RNA 和poly(A) RNA 在RT-PCR中的比较
以5或1μg Hela细胞总 RNA (分别为泳道1和2)或500ng和50ng Hela细胞poly(A) RNA (分别为泳道3和4)。使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶εm RNA 5'端377bp片段和复制酶A m RNA 的643bp片段,两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。

 


 

 

为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的 RNA 需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA ,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的 RNA ,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的 RNA ,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存 RNA 样品的稳定性,可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物。来源于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时,可以使用下列方法沉淀 RNA :加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇,室温放置3-5分钟,10,000×g离心5分钟。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中,在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解 RNA 的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A,B,C对 RNA 的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase。

<center> <p>  </p> </center>
上一篇:contamination in real-time pcr negative control-Real-Tim   下一篇:原位聚合酶链式反应与原位反转录聚合酶链式反应操作规程
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序