PCR与RT-PCR技术
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PCR基础
聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由 RNA 转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。
| Component | Final Concentration |
| Template | 10^4-10^6 copies of DNA template |
| Primer 1 | 0.1-0.5µM |
| Primer 2 | 0.1-0.5µM |
| 10X Reaction buffer | 1X |
| Magnesium | 1.0-3.0mM |
| dNTP mix | 200 mM each dNTP |
| Thermostable DNA polymerase | 1-4 units/100 ml reaction |
RT-PCR基础
RT-PCR将以 RNA 为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的 RNA 分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以为总 RNA 或poly(A) 选择性 RNA 。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
图1. RT-PCR概图
增加RT-PCR灵敏度
分离高质量 RNA
成功的cDNA合成来自高质量的 RNA 。高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。 RNA 的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的 RNA 纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解 RNA 。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取 RNA 。
| TRIzol®试剂步骤略图 |
一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A) RNA 。不管起始模板是总 RNA 还是poly(A) RNA ，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A) RNA 会导致样品间m RNA 丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有m RNA 时，poly(A) RNA 会增加检测的灵敏度。
| 图2. 总 RNA 和poly(A) RNA 在RT-PCR中的比较 |
| 以5或1μg Hela细胞总 RNA （分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A) RNA （分别为泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶εm RNA 5'端377bp片段和复制酶A m RNA 的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。 |
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的 RNA 需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA ，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的 RNA ，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的 RNA ，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存 RNA 样品的稳定性，可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物。来源于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时，可以使用下列方法沉淀 RNA ：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA 的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对 RNA 的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
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