测定植物体内可溶性蛋白质含量(LoWry法与劳里法)

实验原理

 

LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(FolIn-酚)的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe & PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。 LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3~15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。

1. 双缩脲法的原理双缩脲(NH₂ -CO-NH-CO-NH₂ )在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1~10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。

2. 福林-酚法的原理

该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：

   1) 在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。

   2) 此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5~100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。

实验试剂

 

1. Na₂ WO₄ ·2H₂ O

2. Na₂ MoO₄ ·2H₂ O

3. 85%H₃ PO₄

4. 浓HCl

5. Li₂ SO₄ ·H₂ O

6. 溴水

7. 酚酞指示剂

8. Na₂ CO₃

9. NAOH

10. CuSO₄ ·5H₂ O

11. 酒石酸钾钠

12. 牛血清白蛋白

所用试剂均为化学纯或分析纯。

实验设备

 

1. 试管若干

2. 刻度移液管0.5ml 1支，1ml 1支，10ml 1支

3. 定量加样器

4. 圆底烧瓶

5. 冷凝管1套(带橡胶管)

6. 微量滴定管

7. 小烧杯

8. 微量进样器50μl 1支

9. 721分光光度计

10. 恒温水浴器

11. 研钵

12. 玻棒

13. 离心机

14. 离心管

实验材料

 

植物新鲜组织

实验步骤

 

1. 试剂的配制

   1) 碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4%碳酸钠(Na₂ CO₃ )溶液与 0.2Mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等比例混合(2%Na₂ CO₃ ，0.1mol NAOH)；B液：1%硫酸铜(CuSO₄ ·5H₂ O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5%CuSO₄ ·5H₂ O，0.1%酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn－酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。

酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(Na₂ WO₄ ·2H₂ O)100g、钼酸钠(Na₂ MoO₄ ·2H₂ O)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500Ml 的圆底烧瓶中。之后加入85%的H₃ PO₄ 50ml，浓HCl 100ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。

冷却后加入硫酸锂(Li₂ SO₄ ·H₂ O)150g，水50ml，溴水2~3滴，不用回流装置开口煮沸15min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min)。使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1Mol/L H 酸，此为FolIn-酚试剂乙液(FolIn试剂)。

在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

   2) 标准蛋白质溶液的配制称取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg/ml。

2. 标准曲线的绘制

   1)取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。

   2) 在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30℃下放置10Min。

   3) 在每支试管中喷射加入0.5ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30Min。

   4) 准确到30min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。

以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品的测定

   1) 样品的提取：称取鲜样0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。

取1.0Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)、(3)、(4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。

   2) 根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。

4. 结果计算

样品中蛋白的含量(mg/g)=C×VTV1×FW×1000　　　　　　　　　　　　　

式中C：查标准曲线值(μg)；VT：提取液总体积(ml)；FW：样品鲜重(g)；V1：测定时加样量(ml)。

注意事项

 

还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。