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植物体内可溶性蛋白质含量的测定(LoWry法与劳里法)

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一、原理

LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(FolIn-酚)的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后,碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应,形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后,在碱性条件下,这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定,很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe & PHosPHoTungsTATe),使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关,所以可以用于蛋白质含量的测定。LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈,其显色效果比单独使用酚试剂强3~15倍,约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定,对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。

1. 双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物,这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键,也能与铜离子发生双缩脲反应,且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关,所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键,因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得,操作简便,可测定的范围为1~10mg蛋白质,适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定,能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液,如TrIs缓冲液,因为它们产生阳性呈色反应,铜离子也容易被还原,有时出现红色沉淀。

2. 福林-酚法的原理

该方法是双缩脲法的发展,包括两步反应:

(1)在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。

(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原,混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100倍,定量范围为5~100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物,均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响,即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同,标准曲线也不是严格的直线形式。

二、仪器与用具

试管若干;刻度移液管0.5ml 1支,1ml 1支,10ml 1支;定量加样器;圆底烧瓶;冷凝管1套(带橡胶管);微量滴定管;小烧杯;微量进样器50μl 1支;721分光光度计;恒温水浴器;研钵;玻棒;离心机;离心管。

三、试剂

Na2WO4·2H2O;Na2MoO4·2H2O;85%H3PO4;浓HCl;Li2SO4·H2O;溴水;酚酞指示剂;Na2CO3;NAOH;CuSO4·5H2O;酒石酸钾钠;牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。

四、方法

1. 试剂的配制

(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液:4%碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.2Mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等比例混合(2%Na2CO3,0.1mol NAOH);B液:1%硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5%CuSO4·5H2O,0.1%酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn-酚试剂甲液,此试剂只能使用1天。

酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备:称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,加蒸馏水700ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO450ml,浓HCl 100ml,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10H。

冷却后加入硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g,水50ml,溴水2~3滴,不用回流装置开口煮沸15min,以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体溴,继续煮沸15min)。使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞作为指示剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1Mol/L H+酸,此为FolIn-酚试剂乙液(FolIn试剂)。


在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。

(2)标准蛋白质溶液的配制  称取25mg牛血清白蛋白,溶于100ml蒸馏水中,使最终浓度为250μg/ml。

2. 标准曲线的绘制

(1)取7支试管,编号后,分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液,用蒸馏水补足1ml,使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。

(2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液,混匀,于30℃下放置10Min。

(3)在每支试管中喷射加入0.5ml乙液,立即振荡混匀,在30℃下保温30Min。

(4)准确到30min后,以不加标准蛋白试管中的溶液为空白,在500nM下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色,测定光密度值。

以蛋白浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线。

3. 样品的测定

(1)样品的提取:称取鲜样0.5g,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。

取1.0Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中,然后重复步骤2的(2)、(3)、(4),以标准曲线中的0管为空白,测定吸光值。

(2)根据吸光值查标准曲线,求出比色液中的蛋白质含量。

4. 结果计算

样品中蛋白的含量(mg/g)=C×VTV1×FW×1000             (2-1)

式中C:查标准曲线值(μg);VT:提取液总体积(ml);FW:样品鲜重(g);V1:测定时加样量(ml)。

五、注意

还原物质,其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。

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