植物体内可溶性蛋白质含量的测定(LoWry法与劳里法）

一、原理

LoWry法是双缩脲法（BIureT）和福林酚法（FolIn-酚）的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸（PHosPHoMolyBdATe & PHosPHoTungsTATe），使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3~15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的SDS）。

1. 双缩脲法的原理双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1~10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。

2. 福林-酚法的原理

该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：

（1）在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。

（2）此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸（FolIn试剂）还原，混合物深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5~100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。

二、仪器与用具

试管若干；刻度移液管0.5ml 1支，1ml 1支，10ml 1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl 1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。

三、试剂

Na2WO4·2H2O；Na2MoO4·2H2O；85%H3PO4；浓HCl；Li2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NAOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。

四、方法

1. 试剂的配制

（1）碱性铜试剂（相当于双缩脲试剂）的制备首先配制A液：4%碳酸钠（Na2CO3）溶液与0.2Mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液等比例混合（2%Na2CO3，0.1mol NAOH）；B液：1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合（0.5%CuSO4·5H2O，0.1%酒石酸钾钠）。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn－酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。

酚试剂（相当于FolIn试剂）的配备：称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g，加蒸馏水700ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO450ml，浓HCl 100ml，安上回流装置（使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来），使其慢慢沸腾10H。

冷却后加入硫酸锂（Li2SO4·H2O）150g，水50ml，溴水2~3滴，不用回流装置开口煮沸15min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存（冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min）。使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1Mol/L H+酸，此为FolIn-酚试剂乙液（FolIn试剂）。

在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

（2）标准蛋白质溶液的配制  称取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg/ml。

2. 标准曲线的绘制

（1）取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg（必要时可做重复）。

（2）在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30℃下放置10Min。

（3）在每支试管中喷射加入0.5ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30Min。

（4）准确到30min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。

以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品的测定

（1）样品的提取：称取鲜样0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。

取1.0Ml（视蛋白质含量适当稀释）样液加入试管中，然后重复步骤2的（2）、（3）、（4），以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。

（2）根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。

4. 结果计算

样品中蛋白的含量（mg/g）=C×VTV1×FW×1000　　　　　　　　　　　　　（2-1）

式中C：查标准曲线值（μg）；VT：提取液总体积（ml）；FW：样品鲜重（g）；V1：测定时加样量（ml）。

五、注意

还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。