固相团集素结合测定法

实验原理

团集素是牛血清中的一种蛋白质，它与结合在细胞表面和循环中的免疫复合物上的补体C3碎片有强烈的结合性。当把团集素包被在固相载体后，被检血清中结合有补体的免疫复合物就可与其结合，用同位素或酶标记的抗体即可检出。团集素无种属特异性，耐热，能长期保存，因此，用团集素检测循环免疫复合物更为方便。

实验试剂

1. VBS(含Ca² 、Mg² )

2. pH值7.2、0.15mol/L PBS(含0.02mol/L EDTA)

3. pH值5.4、0.01mol/L PBS

4. 牛血清

实验设备

1. Sepharose 4B
2. DEAE纤维素柱用pH值8.0、0.01mol/L EDTA、0.03mol/L PBS(含0.03mol/L NaCl)平衡

实验步骤

1. 提取方法

1) 取牛血清1600ml，56℃灭活30min。

2) 加等量VBS(含Ca² 、Mg² )，混合后，再加一个压积容积的Sepharose 4B。

3) 将其混合后，放室温2h，其间不时搅拌，让牛团集素结合到Sepharose 4B上。

4) 用10容积VBS冲洗Sepharose 4B，可用布氏漏斗、玻璃滤器等。

5) 用800～1000ml pH值7.2 PBS(含0.02mol/L EDTA)解脱牛团集素(可在容器内混合作用1h)。

6) 用pH值5.4、0.01mol/L PBS透析洗脱液。

7) 透析过后，牛团集素即沉淀下来，然后用pH值7.2 PBS(含0.02mol/L EDTA)将其溶解。

8) 过DEAE层析柱用梯度洗脱，氯化钠溶液梯度从0.03→0.4mol/L，团集素最后即被洗脱下来。1600ml牛血清，大约可提取团集素7mg。

2. 团集素活性滴定法

1) EAC43d制备取已洗好的10%绵羊红细胞1容积加1容积稀溶血素混合，于37℃作用1h，用VBS洗2次，配成1%EAVBS混悬液。取8～10mg酵母多糖加1ml新鲜血清混合后，置37℃ 45min，离心，上清液已不含C5～C9。取10ml 1%EA，37℃预温后，加1ml去C5～C9的血清，37℃搅拌10min，用冷CFD洗2次，配成1% EAC43d VBS悬液备用。

2) 凝集滴定法取团集素用含0.1%明胶的VBS对倍稀释(可用微量血凝板)，最终每孔含不同稀释度的团集素50μl，每孔加50μl 1% EAC43d，振摇混匀后，4℃过夜。发生凝集的最高终点稀释度即为团集素单位数。

3. 测定方法(放射免疫法)

1) 取纯化的团集素用pH值9.5 VBS(含0.02%NaN₃ )稀释到5μg/ml。取聚苯乙烯塑料管，每管加该团集素0.25ml，置37℃ 3h，使团集素包被在塑料管壁上(包被后，可用1个月以上)。

2) 实际测定前，用含0.05%Tween20的VBS冲洗3次，每次静置3min，吸干后，加入各试液，室温作用1h，用VBSTween20冲洗3次，每次静置3min，吸干后，各管加125I标记的抗IgG 0.2ml(加入标记抗体含量应预先调试恰当)，置室温4h，用VBSTween20洗3次后，用γ计数器测定cpm。