血清总胆红素和结合胆红素测定实验

一、实验试剂；

1. 咖啡因一苹果酸钠试剂，称取无水醋酸钠41.0g（CH3COONa·3H2O6 3.0g）苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA Na2）0.5g，溶于500ml蒸馏水中，再加入咖啡因25.0g搅拌使溶解（加入咖啡因后不发生加热溶解），用蒸馏水补足1升，混匀，用滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。

2. 碱性酒石酸钠溶液：称取氢氧化钠75g酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g用蒸馏水溶解并补足至1升，混匀。置塑料瓶中，室温保存。

3. 5.0g/L亚硝酸钠溶液：称取亚硝酸钠（NaNO2）5.0g，用蒸馏水溶解并稀释至100毫升，混匀，贮棕色瓶中，置冰箱保存，稳定不少于3个月，作10倍稀释成50g/L，贮存冰箱，稳定不少于2周。

4. 50g/L对氨基苯磺酸溶液：称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g溶于800ml蒸馏水中加人浓HCl 15ml，用蒸馏水补足至1升。

5. 重氮试剂：临用前取5.0g/L亚硝酸钠溶液 0.5ml和5.0g/L对氨基苯磺酸溶液，20ml混合。6. 50g／L叠氮钠溶液：称取叠氮钠059以蒸馏水溶解并稀释至100毫升。

7. 胆红素标准液：171umol/dL(10ml/dL)准确称取符合要求的胆红素10mg加人1ml二甲亚矾，用玻璃搅拌，使成混悬液，加入 0.05 mol／L碳酸钠溶液2ml使胆红素完全溶解。移入100容量瓶中，用稀释液同血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L盐酸2ml边加边摇（勿用力摇，以免产生气泡），最后以稀释同血清补足300ml，配制过程中应避光，贮存容器，用黑纸包裹，置4℃冰箱3天内有效，要求配后尽快做标准曲线。

二、实验操作；

充分混合后波长600nm，对照管调零，读取各管光密度，或用水调零。读取测定管及对照管吸光度，用测定管吸光度与对照管吸光度之差值（Au-Ac）在标准曲线上画出相应的胆红素浓度。

标准曲线的制作，按下表稀释胆红素贮存液不同浓度

将以上各管充分混匀（但不可产生气泡），按血清总胆红素测定法操作，每一浓度作3个平行管，每一浓度分别作标准对照管，用各自的标准对照管调零。读取各管标准管的吸光度，每管还应减去稀释用血清的总胆红素的吸光度，然后与相应的胆红素浓度绘制标准曲线。

参考值：血清总胆红素5.1-19.0 umol/L（0.3-1.1mg/dL）

血清结合胆红素（1分钟）1.7--6.8 umol/L（0.1-0.4mg/dL）

l. 本法测定血清总胆红素在10-37℃条件下，不变温度变化德影响，显色在2小时内非常稳定。

2. 本法灵敏度高（摩尔吸光度系数为74380±866L·mol-1·cm-1）且可避免其他有色物质的干扰。

3. 轻度溶血对本法无影响，但严重溶血可使测定结果偏低。

4. 用叠氮钠作防滴剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不显色。

5. 胆红素对光敏感，标准及标本均应尽量避光。

6. 脂血对肠溶色素对测定有干扰，应尽量取空腹血。

7. 胆红素大于100mg/L的标本可减少标本用量，或用生理盐水稀释后重做。