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组织免疫沉淀中染色质的制备

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实验步骤

 

1.   交联

1)   用刀片将冰冻或新鲜组织切成小块 (1-3 mm3 )。

2)   取一个空的 15 ml 锥形离心管,称重,放入组织后再次称重,计算组织重量。

3)   在通风橱中配制交联所用溶液。每克组织加 10 ml PBS。加入终溶度 1.5% (v/v) 的甲醛,室温旋转 15 分钟。

4)   加入甘氨酸至终浓度 0.125M,以终止交联反应。继续室温旋转 5 分钟。

5)   组织样本离心,4 °C 720 rpm,离心 5 分钟。

6)   吸弃培养基,用 10 ml 冰上预冷的 PBS 洗涤。4 °C 720 rpm,离心 5 分钟,弃掉洗涤缓冲液。

2.   组织降解

1)   将 1 ml 枪头的末端剪掉,使吸头口增大。

2)   50-100 mg(3-4 块)的组织用 1ml PBS 重悬。

3)   将溶液加入锥形研磨管中,研磨 2 分钟。

4)   将 18 号钝圆的针头连接到 1 ml 注射器上,将其插入锥形研磨管中收集细胞。将细胞加入一个锥形管中,冰上放置。

5)   重复步骤 2.2 直到所有组织均处理完。

6)   镜下观察细胞悬液,以确定得到的是单细胞悬液。如果需要进一步研磨,可在组织中加入更多的 PBS,重复步骤 2.2 到 2.5,直至所有组织均研磨成均一的悬液。

7)   将细胞离心,1000 rpm, 4 °C,离心 10 分钟。估算细胞沉淀的体积以备下一步操作。

8)   小心吸弃上清液,用FA裂解缓冲液重悬沉淀(每 1x107 个细胞加入 750 μl)。

9)   从第 2 阶段(超声处理)开始,继续进行交联染色质免疫沉淀反应。

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