如何做好磷酸钙-DNA共沉淀法实验？

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在分子生物学中，磷酸钙沉淀法特指将外源DNA转入真核细胞的一种方法。将氯化钙、DNA和磷酸缓冲液混合，形成吸附DNA的不溶性羟磷灰石细微颗粒附着在细胞表面，通过胞饮进入细胞。此方法对于贴壁细胞转染 是最常用并首选的方法。

核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核 中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。

下列是其实验步骤：

一、配液

1. 2×HBS：1.63g NaCl;1.19g Hepes;0.023g Na2PO4-2H2O;加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存

2. 2mmol/L CaCl2 过滤除菌

3. TE：0.1mmol/L EDTA 、1mmol/L Tris-HCL，PH8.0

4. G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

5. G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

二、操作步骤[方法一]：

1.供体DNA制备：方法按DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

2. 受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104 /cm2 ，用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。

3. DNA-磷酸钙沉淀物的制备

① 将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。

② 取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混匀30秒。

③ 然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。

4. 转染受体细胞

①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml(25ml培养瓶)。

②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。

③置37℃ 5% CO2 培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。

④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。

⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。

⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。

⑦2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。

本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。若以获取“转化灶”为目的，可不加入PSV2-neo DNA只需将从癌细胞中提取的DNA导入受体细胞即可，其方法如下：

三、DNA转染[方法二]：

1. 配制磷酸转染液：NaCl 8.0g;Hepes 5.0g 用时现配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65;Na2HPO4 0.099g 消毒灭菌，-20℃贮存备用;加温水至 1000mL

2. 按前面介绍的方法提取癌细胞DNA。

3. 取供体DNA50～100μg，加3M NaCl或醋酸钠，使最终浓度至0.3M混匀。

4. 再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟，去上清。

5. 加入转染缓冲液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2 ，含最终浓度为125mM，用吸管轻轻吹打三次(不用搅拌器以防DNA袢结)，置室温下10～30分钟，待液体透明度降低，出现微浊兰色时，即可用于转染细胞。

6. 取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞，在转染前4小时，更换培养液(5ml/瓶)1次。

7. 转染：向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小时。

8. 培养：弃去培养液，用15%甘油处理3分钟，无血清培养漂洗1次，接近汇合时血清用量降至5%，培养2～3周。

9. 检测：逐日观察，待出现“转化灶”后，分离，扩大培养建立转化细胞株。