大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶E292对于氨基酰化活性的作用
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实验试剂
L-Leucine，ATP，DTT，焦磷酸钠(tetrasodium pyrophosphate)和HA-Ultrogel购自美国Sigma公司。
L-[I4 C]-亮氨酸和DEAE-SepharoseTM Fast Flow购自英国Amersham公司。
限制性内切酶和T4DNA连接酶购自立陶宛MBI Ferments公司。
实验材料
实验步骤
以构建的编码大肠杆菌LeuRS的基因leuS作为模板，利用两步PCR反应扩增得到六个LeuRS变种酶的基因序列(图1)。
2) 用0.5 mM IPTG诱导6小时，取出20ul培养液，加入等体积的SDS-PAGE上样缓冲液，100o C煮沸10分钟，离心取上清液进行SDS-PAGE检查转化子中各变种酶基因的表达情况。
3) 将高表达转化子5 mL菌液转接至500 mL氨苄- LB液体培养基中37 o C，300 rpm培养至对数生长期，用0.5 mM IPTG诱导8小时，收集菌体。
4) 将湿菌体悬浮于20毫升0 o C预冷的破菌缓冲液(50 mM磷酸钾缓冲液，pH6.8，含10 mM巯基乙醇，2 mM PMSF，10%甘油)中，冰浴超声波破菌。
5) 将破菌液于4o C，12，000g离心30分钟后继续经4 o C， 150，000g超离心1小时。
7) 收集的含LeuRS以及变种酶的洗脱峰，用PEG 20000浓缩，对10 mM pH 6.8的磷酸钾缓冲液透析。加入50% 0 o C预冷的甘油，保存于-20 o C。
粗抽液蛋白质的浓度用Bradford方法测定。纯化后的LeuRS以及变种酶的浓度可以通过以下公式计算得到：1 A280 =1.62 mg/ml。
