土壤微生物DNA提纯方法及纯度检测

实验试剂

DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃ PO₄ , 1.5 M NaCl, pH 8.0)

溶菌酶(50 mg/mL)

蛋白酶K(20 mg/mL)

10% SDS

RNAse 20 mg/mL

聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)

交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)

TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)

PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂ HPO₄ , 2 mmol/L KH₂ PO₄ , pH 7.4)

NaOH溶液

10% HCl

TE缓冲液(pH 7.6)

氯仿

异戊醇

异丙醇

实验设备

高速离心机

PVPP离心柱

Sephadex离心柱

Sephadex G-200树脂

3S DNA Purification Kit纯化柱

电泳槽

电泳仪

2 mL、1.5 mL离心管

实验材料

10 g土样的粗DNA样品

实验步骤

1. 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)在DNA提取过程中的纯化作用比较

(1) 称取0.1 g土样，置于2 mL灭菌的离心管中，直接加入500 μL DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃ PO₄ , 1.5 M NaCl, pH 8.0)，10 μL溶菌酶(50 mg/mL)，2.5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，37℃水浴30 min，加100 μL 10% SDS 65℃水浴1 h，8 000 r/min离心5 min，上清用等体积氯仿:异戊醇抽提后用0.6 倍体积异丙醇沉淀，30 μL ddH₂ O(含RNAse 20 mg/mL)溶解；

(2) 称取0.1 g土样加入0.1g PVPP，加入500 μL DNA提取缓冲液，其余同(1)；

(3) 称取0.1 g土样加入0.1g PVP，加入500 μL DNA提取缓冲液，其余同(1)；

(4) 称取0.1 g土样加入1 mL TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)，涡旋混匀5 min，12 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀反复洗两遍或至上清基本近无色，再用1 mL PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂ HPO₄ , 2 mmol/L KH₂ PO₄ , pH 7.4)缓冲液洗一遍，然后再加入500 μL DNA提取缓冲液，其余同(1)；

(5) 称取0.1 g土样加入1 mL TENPP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVPP, pH 10.0)，其余同(4)。

0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。

2. 柱纯化

(1) PVPP离心柱：将1 g酸化PVPP(用10% HCl煮沸10分钟，NaOH中和后再用水洗直至中性晾干即可)加入1 mL离心柱上，将离心柱放在1.5 mL离心管上，加入1 mL TE，10 000 r/min离心1 min，倒空离心管再重复离心一次脱干PVPP。将离心柱放在新的1.5 mL离心管上。将100 μL粗DNA在PVPP离心柱上，10 000 r/min离心1 min；

(2) Sephadex离心柱：Sephadex G-200树脂用TE缓冲液(pH 7.6)在4℃平衡过夜，将细碎的颗粒去除。在1 mL离心柱上加入500 μL平衡后的Sephadex G-200凝胶，3 000 r/min离心直至凝胶体积不再变化。加入100 μL粗体DNA样，3 000 r/min离心1 min；

(3) 结合Sephadex柱和PVPP柱：取100 μL粗DNA样品，经PVPP柱10 000 r/min离心1 min，再经Sephadex柱3 000 r/min离心1 min；

(4) 商品纯化柱：使用3S DNA Purification Kit纯化柱，将100 μL粗DNA以PCR产物方式按照说明进行纯化，必要时使用BS缓冲液反复漂洗2~3次，30 μL ddH₂ O回收。

0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。

3. 电泳法：

(1) 低电压长时间电泳法：1%琼脂糖凝胶电泳在25 V进行4~8 h以上；

(2) PVP电泳法：在1%琼脂糖凝胶中加入2% PVP，25 V进行电泳4~8 h以上；

电泳结束后切下DNA主带，用凝胶回收试剂盒进行胶回收。

0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。