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土壤微生物DNA提纯方法及纯度检测

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2202

实验试剂

 

DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3 PO4 , 1.5 M NaCl, pH 8.0)

溶菌酶(50 mg/mL)

蛋白酶K(20 mg/mL)

10% SDS

RNAse 20 mg/mL

聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)

交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)

TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)

PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2 HPO4 , 2 mmol/L KH2 PO4 , pH 7.4)

NaOH溶液

10% HCl

TE缓冲液(pH 7.6)

氯仿

异戊醇

异丙醇

实验设备

 

高速离心机

PVPP离心柱

Sephadex离心柱

Sephadex G-200树脂

3S DNA Purification Kit纯化柱

电泳槽

电泳仪

2 mL、1.5 mL离心管

实验材料

 

10 g土样的粗DNA样品

实验步骤

 

1. 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)在DNA提取过程中的纯化作用比较

   (1) 称取0.1 g土样,置于2 mL灭菌的离心管中,直接加入500 μL DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3 PO4 , 1.5 M NaCl, pH 8.0),10 μL溶菌酶(50 mg/mL),2.5 μL蛋白酶K(20 mg/mL),37℃水浴30 min,加100 μL 10% SDS 65℃水浴1 h,8 000 r/min离心5 min,上清用等体积氯仿:异戊醇抽提后用0.6 倍体积异丙醇沉淀,30 μL ddH2 O(含RNAse 20 mg/mL)溶解;

   (2) 称取0.1 g土样加入0.1g PVPP,加入500 μL DNA提取缓冲液,其余同(1);

   (3) 称取0.1 g土样加入0.1g PVP,加入500 μL DNA提取缓冲液,其余同(1);

   (4) 称取0.1 g土样加入1 mL TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0),涡旋混匀5 min,12 000 r/min离心1 min,弃上清,沉淀反复洗两遍或至上清基本近无色,再用1 mL PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2 HPO4 , 2 mmol/L KH2 PO4 , pH 7.4)缓冲液洗一遍,然后再加入500 μL DNA提取缓冲液,其余同(1);

   (5) 称取0.1 g土样加入1 mL TENPP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVPP, pH 10.0),其余同(4)。

0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。

2. 柱纯化

   (1) PVPP离心柱:将1 g酸化PVPP(用10% HCl煮沸10分钟,NaOH中和后再用水洗直至中性晾干即可)加入1 mL离心柱上,将离心柱放在1.5 mL离心管上,加入1 mL TE,10 000 r/min离心1 min,倒空离心管再重复离心一次脱干PVPP。将离心柱放在新的1.5 mL离心管上。将100 μL粗DNA在PVPP离心柱上,10 000 r/min离心1 min;

   (2) Sephadex离心柱:Sephadex G-200树脂用TE缓冲液(pH 7.6)在4℃平衡过夜,将细碎的颗粒去除。在1 mL离心柱上加入500 μL平衡后的Sephadex G-200凝胶,3 000 r/min离心直至凝胶体积不再变化。加入100 μL粗体DNA样,3 000 r/min离心1 min;

   (3) 结合Sephadex柱和PVPP柱:取100 μL粗DNA样品,经PVPP柱10 000 r/min离心1 min,再经Sephadex柱3 000 r/min离心1 min;

   (4) 商品纯化柱:使用3S DNA Purification Kit纯化柱,将100 μL粗DNA以PCR产物方式按照说明进行纯化,必要时使用BS缓冲液反复漂洗2~3次,30 μL ddH2 O回收。

0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。

3. 电泳法:

   (1) 低电压长时间电泳法:1%琼脂糖凝胶电泳在25 V进行4~8 h以上;

   (2) PVP电泳法:在1%琼脂糖凝胶中加入2% PVP,25 V进行电泳4~8 h以上;

电泳结束后切下DNA主带,用凝胶回收试剂盒进行胶回收。

0.8%琼脂糖常压电泳(150 V, 30 min)检测。

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