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酵母表达载体的构建与酵母转化

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10602

实验试剂

 

试剂配制:

1 .1 M Tris.Cl(pH 7.5)(100 ml):12.1g Tris碱,加80 ml ddH2 O,浓HCl调pH 7.5,定容至100 ml;

2. 0.5 M EDTA(pH 8.0) (100 ml):18.6g EDTANa2 .2H2 O, 70 ml ddH2 O,NaOH调pH 8.0,定容至100 ml;

3. 1xTE(pH 7.5) (100 ml):1 ml 1 M Tris.Cl(pH7.5),0.2 ml 0.5 M EDTA(pH 8.0),加水定容至100 ml;

4. I0XTE(pH 7.5)(100 ml):10 ml 1 M Tris.Cl(pH7.5),2 ml 0.5 M EDTA(pH8.0),加水定容至100 ml;

5. I0XLiAC(1 M LiAC):3.15 g LiAC,加水定容至50 ml,稀HCl调pH 7.5;

6. 50% PEG4000:50 g PEG4000,加水定容至100 ml;

7. TE-LiAC(100 ml):现配现用,lx体积I0xTE(pH 7.5); 1 x体积l0xLiAC,8x体积无菌超纯水,混匀;

8. TE-LiAC-PEG溶液:现配现用,8X体积50% PEG4000,1 X体积l0XTE,1 X体积l0XLiAC(pH 7.5),混匀;

9. YPD培养基:1%酵母提取物,2%蛋白陈,2%葡萄糖,NaOH调pH 7.0(固体培养基中需加1.5%琼脂粉)。

 

实验步骤

 

1. 酵母表达载体的构建

    1) 用引物扩增目的基因全长片段,将它克隆到pGEM-T Easy载体上,转化大肠杆菌DH5α,分别获得阳性克隆;

    2) 提取酵母表达载体pYES2和目的片段的质粒;

    3) 用EcoR I和Not I双酶切pYES2载体和连有各目的片段的pGEM-T Easy载体;

    4) 琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段;

    5) 回收目的片段和酵母载体片段,用T4 DNA连接酶对酵母载体和片段进行连接;

    6) 各连接产物转化大肠杆菌DH5α,获得阳性克隆,提取质粒。

2. 酵母感受态细胞的制备和乙酸锉转化

    1) 挑取2-3mm的CY162酵母单菌落接种于3 ml的YPD培养基中,30℃震荡培养8 h;

    2) 吸取5ul培养的酵母转移到含有50 ml YPD的250 ml三角瓶中,30℃,230-250rpm培养16-20 h,OD600 需要达到0.15-0.3 ;

    3) 室温,700 g,收集菌体5min,弃上清,用100 ml YPD重旋菌体,30℃,培养3-5 h,OD600 需要达到0.4-0.5;

    4) 室温,700 g,收集菌体5min,弃上清,用60ml的无菌水重旋菌体;

    5) 室温,700 g,收集菌体5min,弃上清,用3ml1 xTE/LiAC重旋菌体;

    6) 将酵母悬浮液分到2个l.5ml的离心管中,高速离心15sec,弃上清,加入600 ul的1 XTE/LiAC重旋菌体,感受态制备完毕;

    7) 取100ul上述感受态细胞于1.5 ml离心管中,加入15 u1重组质粒(约2ug)(pYES2空质粒作对照),5 ul ssDNA(煮沸5 min,冰浴5 min)和600ulTE-LiAC-PEG溶液涡旋或枪头(蓝枪头)吸打混匀;

    8) 30℃,200 rpm,振荡培养30 min, 42℃水浴15 min,再冰浴10 min;

    9) 3000 rpm,收集菌体,弃上清,加入0.3 ml 1 xTE(pH 7.5),涡旋或枪头吸打混匀,取150ul转化液涂布到SMM选择培养基上,30℃,2-4 d,筛选阳性克隆用于互补试验。

3. 酵母抗逆实验

    1) 挑取pYES2,pYES2-GhMT3a的酵母阳性克隆,加入5ml YPD溶液,30℃,培养48h

    2) 用YPD(100 mM K )培养基将所有克隆的OD600 调整到2.0;

    3) 取lml酵母培养物,离心30 sec;

    4) 用lml ddH2 0重悬菌体,再离心,再用1 ml ddH2 0重悬菌体;

    5) 用ddH2 0将所有培养物按照1:10,1:100和1:1000稀释;

    6) 将稀释的不同浓度的培养物点到含有不同浓度P或者H20z的YPD固体培养基上,30℃培养,观察互补结果;

    7) 同时用含有2mM PQ或2mM H2 02 的YPD培养基进行液体培养,在600nm处测吸光度。

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