酵母表达载体的构建与酵母转化

实验试剂

试剂配制：

1 .1 M Tris.Cl(pH 7.5)(100 ml)：12.1g Tris碱，加80 ml ddH₂ O，浓HCl调pH 7.5，定容至100 ml；

2. 0.5 M EDTA(pH 8.0) (100 ml)：18.6g EDTANa₂ .2H₂ O， 70 ml ddH₂ O，NaOH调pH 8.0，定容至100 ml；

3. 1xTE(pH 7.5) (100 ml)：1 ml 1 M Tris.Cl(pH7.5)，0.2 ml 0.5 M EDTA(pH 8.0)，加水定容至100 ml；

4. I0XTE(pH 7.5)(100 ml)：10 ml 1 M Tris.Cl(pH7.5)，2 ml 0.5 M EDTA(pH8.0)，加水定容至100 ml；

5. I0XLiAC(1 M LiAC)：3.15 g LiAC，加水定容至50 ml，稀HCl调pH 7.5；

6. 50% PEG4000：50 g PEG4000，加水定容至100 ml；

7. TE-LiAC(100 ml)：现配现用，lx体积I0xTE(pH 7.5)； 1 x体积l0xLiAC，8x体积无菌超纯水，混匀；

8. TE-LiAC-PEG溶液：现配现用，8X体积50% PEG4000，1 X体积l0XTE，1 X体积l0XLiAC(pH 7.5)，混匀；

9. YPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白陈，2%葡萄糖，NaOH调pH 7.0(固体培养基中需加1.5%琼脂粉)。

实验步骤

1. 酵母表达载体的构建

1) 用引物扩增目的基因全长片段，将它克隆到pGEM-T Easy载体上，转化大肠杆菌DH5α，分别获得阳性克隆；

2) 提取酵母表达载体pYES2和目的片段的质粒；

3) 用EcoR I和Not I双酶切pYES2载体和连有各目的片段的pGEM-T Easy载体；

4) 琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段；

5) 回收目的片段和酵母载体片段，用T4 DNA连接酶对酵母载体和片段进行连接；

6) 各连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得阳性克隆，提取质粒。

2. 酵母感受态细胞的制备和乙酸锉转化

1) 挑取2-3mm的CY162酵母单菌落接种于3 ml的YPD培养基中，30℃震荡培养8 h；

2) 吸取5ul培养的酵母转移到含有50 ml YPD的250 ml三角瓶中，30℃，230-250rpm培养16-20 h，OD₆₀₀ 需要达到0.15-0.3 ；

3) 室温，700 g，收集菌体5min，弃上清，用100 ml YPD重旋菌体，30℃，培养3-5 h，OD₆₀₀ 需要达到0.4-0.5；

4) 室温，700 g，收集菌体5min，弃上清，用60ml的无菌水重旋菌体；

5) 室温，700 g，收集菌体5min，弃上清，用3ml1 xTE/LiAC重旋菌体；

6) 将酵母悬浮液分到2个l.5ml的离心管中，高速离心15sec，弃上清，加入600 ul的1 XTE/LiAC重旋菌体，感受态制备完毕；

7) 取100ul上述感受态细胞于1.5 ml离心管中，加入15 u1重组质粒(约2ug)(pYES2空质粒作对照)，5 ul ssDNA(煮沸5 min，冰浴5 min)和600ulTE-LiAC-PEG溶液涡旋或枪头(蓝枪头)吸打混匀；

8) 30℃，200 rpm，振荡培养30 min， 42℃水浴15 min，再冰浴10 min；

9) 3000 rpm，收集菌体，弃上清，加入0.3 ml 1 xTE(pH 7.5)，涡旋或枪头吸打混匀，取150ul转化液涂布到SMM选择培养基上，30℃，2-4 d，筛选阳性克隆用于互补试验。

3. 酵母抗逆实验

1) 挑取pYES2，pYES2-GhMT3a的酵母阳性克隆，加入5ml YPD溶液，30℃，培养48h

2) 用YPD(100 mM K )培养基将所有克隆的OD₆₀₀ 调整到2.0；

3) 取lml酵母培养物，离心30 sec；

4) 用lml ddH₂ 0重悬菌体，再离心，再用1 ml ddH₂ 0重悬菌体；

5) 用ddH₂ 0将所有培养物按照1:10，1:100和1:1000稀释；

6) 将稀释的不同浓度的培养物点到含有不同浓度P或者H20z的YPD固体培养基上，30℃培养，观察互补结果；

7) 同时用含有2mM PQ或2mM H₂ 0₂ 的YPD培养基进行液体培养，在600nm处测吸光度。