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血中苯妥英钠和苯巴比妥钠的高效毛细管电泳优化分析

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1343

摘要 建立了血中的苯妥英钠和苯巴比妥钠的胶束电动毛细管电泳分析方法(MEKC)。 以 25 mmol/L硼酸钠溶液(pH=8.60)、 30 mmol/L 十二烷基硫酸钠(胶束相)和甲醇30 %(φ)为缓冲液, 恒定电压 25 kV(电流30~35 μA), 检测波长200 nm, 毛细管柱长37 cm。 苯妥英钠和苯巴比妥钠两种药物质量浓度的线性范围为1.0~ 80 mg/L, 最低检出质量浓度为1.0 mg/L 。 该法为临床提供了一种高效、 快速的血中药物含量定量测定的新手段。
关键词 苯妥英钠, 苯巴比妥钠, 胶束电动毛细管电泳
Advanced Analysis of Phenytoin Sodium and Phenobarbital Sodium in Blood Using High Performance Capillary Chromatography
Huang Huiling, Zhi Dashi
(The Neurosurgical Institute of Tianjin, Tianjin 300060)
Zhou Xiaodong
(The Basic Medical Institute of Chinese Medical Academy, Beijing 100005)
Abstract The determination of phenytoin sodium and phenobarbital sodium by micellar electrokinetic capillary chromatography(MEKC) with sodium dodecyl sulphate(SDS)as the micellar phase is described. The factors affecting the micellar electrokinetic separation were studied for quantitative determination of two components in standards and in blood. The optimal separation of two components was achieved with 25 mmol/L borate sudium buffer(pH 8.60 ),30 mmol/L SDS solution, 30% methanol as a buffer and a constant voltage of 25 kV(current of 30~35 μA). The method has a good linearity in the range of 1.0~80 mg/L of the drugs and detection limit of 1.0 mg/L. Thus, the electrokinetic capillary chromatography is demonstrated to be a new, rapid, highly effective method for analysing the drugs in human blood quantitatively.
Keywords Phenytoin sodium, Phenobarbital sodium, Miccellar electrokinetic capillary chromatography
  苯妥英钠及苯巴比妥钠为传统的抗癫痫药物,其在血和尿中的分析测定国内外多以HPLC和GC的报道较多[1],费时及耗费试剂。免疫学分析快且灵敏度较高[2], 但它只能单一检测, 并且由于抗原抗体反应而会引起交叉反应。 毛细管电泳分析具有试剂用量少、 预处理简单、 分析快速等诸多优点,已有一些关于用之分析各种苯巴比妥类药物的文献报道[3~5], 但多数为定性分析, 且分析时间较长, 血清样品处理繁琐。 我们利用胶束电动毛细管电泳分析方法(MEKC)考察了苯妥英钠和苯巴比妥钠的分离条件, 选择了最佳色谱分析条件分离血中苯妥英钠和苯巴比妥钠药物, 为血中的药物定量监测提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪 器
  美国Beckman公司的5500型毛细管电泳仪, 配有紫外检测器(波长为200 nm), 486 微机及黄金软件; 石英毛细管空柱(河北永年光纤厂出品)为50 μm (ID), 长度分别为 67 、 47 和37 cm(有效分离长度分别为60、 40和30 cm)。
1.2 试 剂
  苯妥英钠(PHT)、 苯巴比妥钠(PB)标准品为北京市神经外科研究所生化室提供。 十二烷基硫酸钠(SDS)、 乙酸乙酯购于SIGMA。硼酸钠、 磷酸二氢钠、 甲醇、 氢氧化钠、乙腈等均为国产分析纯试剂。
1.3 溶液的配制
  苯妥英钠和苯巴比妥钠分别用50%(φ)甲醇溶解, 质量浓度均为 1 g/L, 两种标准品混合后, 用缓冲液稀释成160、 80、 40、 20、 10、 5和1 mg/L的质量浓度制作标准曲线。 缓冲液为 25 mmol/L的硼酸钠、 10 mmol/L磷酸二氢钠、 30 mmol/L SDS和30 %(φ)的甲醇, pH为8.60。
1.4 测定方法
  每次运行前, 用0.1 mol/L氢氧化钠、 蒸馏水和缓冲液分别冲洗 2 min、 2 min和3~6 min。分离温度为 20℃, 电压为 25 kV(运行电流 30~35 μA), 气压进样 5 s, 样品从正极→负极。1.5 血清、 血浆的预处理 抽取健康人血 4 mL, 分成两份,其中一份加肝素抗凝,取血清或血浆100 μL,加入等量乙腈,混匀后放置 5 min, 7 000 r/min离心, 取上清液上机分析。

2 结果与讨论
2.1 分离条件的选择
2.1.1 不同pH缓冲液及电压的影响 将25 mmol/L硼酸钠、 30 mmol/L SDS 的缓冲液pH调节为 6.70、 7.74、 8.20、 8.60、 9.24, 结果表明: 缓冲液的pH为 6.70和 9.24时, 基线噪音太大。 最佳pH为 8.60左右。 pH的变化对电流的影响不大。
  随着电压的增大, 电流增大, 迁移时间缩短, 容量因子也增大, 最佳电压在25 kV左右。
2.1.2 SDS加入量的影响 两组分的迁移时间随着 SDS的浓度增加而增加, 水相分子苯巴比妥钠更为显著。 容量因子随着 SDS的浓度增加而成线性增加, 但电流也随之增大, 相应地焦耳热也增加, 因此, SDS浓度选择为 30 mmol/L。 无 SDS的缓冲液(即区带电泳)能很好地分离标准品, 但对于血清或血浆中的样品则有内源性成分干扰。
2.1.3 不同甲醇含量的影响 在 25 mmol/L硼酸钠、 30 mmol/L SDS 的缓冲液中, 加入不同体积分数的甲醇(0%、 10%、 20%、 30%、 40%), 发现甲醇含量越大, 容量因子越大, 两组分越能分开。 缓冲液中加入甲醇能相应降低电流, 但当甲醇含量为 40%时电流较小(约10 μA), 且甲醇峰消失。 故甲醇选择在≤30 %(表1)。
表1 甲醇含量(ψ)对分离电流(I)及电渗流(μos)影响
Table1 Influence of methanol on current and electroosmotic flow

ψ/%

0

10

15

20

30

40

I/μA

70.4

60.4

55.7

46.9

39.2

11.2

μos(10.-9.m2.V-1.s-1)

0

41.6

33.7

31.4

28.2

 


μos=毛细管总长×从进样端到检测器长度/电压×甲醇迁移时间
在实验中我们观察到:在25 mmol/L硼酸钠, 30 mol/L SDS的缓冲液中,当pH为8.20时, 用 20%甲醇在不同电压下走样, 苯妥英钠出峰在后; 30 %甲醇不同电压走样时苯妥英钠出峰在前。 而 pH 为8.6时不管甲醇含量多大, 苯妥英钠出峰均在前。 说明在pH为8.2时, 不同甲醇含量可以改变分离组分与胶束的相互作用: 30%甲醇时苯妥英钠较多地停留在缓冲液中, 保留时间短而先出峰; 20%甲醇则改变了苯妥英钠的特性。 而在pH为8.6时组分分离不受甲醇的影响, 按照组分的疏水作用大小出峰。这似乎表明 MEKC中组分的分离有一个临界点, 不同缓冲液、 有机溶剂以及pH值均会影响组分的出峰顺序, 甲醇如何影响出峰顺序有待于进一步探讨。
2.1.4 缓冲液浓度的影响 其他条件不变,用20、30和40 mmol/L缓冲溶液走样, 发现缓冲溶液的浓度为30 mmol/L时两组分的分离效果最佳。在其它条件相同的情况下, 磷酸盐缓冲液不能将标准品分开。
2.1.5 毛细管长度的影响 用27、 37、 47、 67 cm的毛细管分别进样, 出峰时间和电流如表2。 随着毛细管的加长, 出峰时间也加长, 电流相应减少。我们选择37 cm的毛细管。
表2 毛细管长度对出峰时间(tR)的影响
Table2 Infuence of the length of capillary in tR

L/cm

PHT
tR/min

PB
tR/min

I/μA

27

 

 

182.5

37

3.215

4.351

32.15

47

6.228

7.284

24.58

67

15.696

16.913

11.26


2.2 血清或血浆的预处理
  用3种沉淀剂: 乙腈、 乙酸乙酯和高氯酸, 分别等量加入含有标准品的血清样品中, 离心, 取上清液上机分析, 结果只有用乙腈沉淀的血清样品才能分析出苯妥英钠和苯巴比妥钠, 且不受其它杂峰的干扰,其它两种沉淀的血清样品均无峰出现。 电泳图谱见图1(略), 其工作条件为25 mmol/L硼酸钠-30 mmol/L SDS-30 %(φ)甲醇缓冲液; 25 kV 电压; 37 cm毛细管。
2.3 样品测定
2.3.1 标准曲线 在最佳测试条件下, 将 1、 5、 10、 20、 40、 80、 160 mg/L的标准溶液依顺序进样 3次, 得到标准曲线。 质量浓度与峰面积的的回归方程为:
苯妥英钠 Y=63.739 5 X - 1.905 88 r=0.997 00
苯巴比妥钠 Y=56.468 9 X - 0.879 7 r=0.998 14
其中 Y为样品质量浓度, X为峰面积。 在1.0~80 mg/L 的质量浓度中均有较好的线性范围, 最低检出质量浓度为1.0 mg/L。
2.3.2 回收率 取健康人血清, 加入两种标准品, 使其质量浓度分别为10、 20、 50 mg/L, 按同样方法测定3次, 苯妥英钠的回收率平均为 95.4%, 相对标准偏差(RSD)为 2.0 %; 苯巴比妥钠的回收率平均为97.3 %, RSD为1.6%。 日内RSD为0.64%, 日间 RSD为 5.5%。 其它药物如安定、 卡马西平和丙戊酸钠等对本实验无干扰。
2.3.3 血清样品的测定 8名口服苯妥英钠或苯巴比妥钠的癫痫患者血清, 用本法测定药物含量, 结果见表3。测定血清和血浆的结果无显著性差异。
表3 患者血清样品的测定
Table3 The detected results of the drugs in serum from patients

No

PHT
p/(mg.L-1)

PB
p/(mg.L-1)

1

2.101

 

2

7.454

 

3

 

2.434

4

1.336

 

5

 

9.346

6

 

0.447

7

5.263

 

8

11.521

 


参考文献
 1 Ubbink J B, Lagendijk J, Vermaak W H. Simple high - performance liquid chromatographic method to verify the direct barbituric acid assay for urinary cotinine. J Chromatogr, 1993, 620(2): 254
 2 Colbert D L, Smith D S, Landon J, et al. Sing - reagent polarization fluoroimmunoassay for barbiturates in urine. Clin Chem, 1984, 30: 1765
 3 Lee K J, Heo G S. Analysis of antiepileptic drugs in human plasma using micellar electrokinetic capillary chromatography. J Chro - matogr, 1992, 608(1-2): 243
 4 Thormann W, Meier P, Marcolli C, et al. Analysis of barbiturates in human serum and urine by high performance capillary electro - phoresis―micellar electrokinetic capillary chromatography with on - column multiwavelength detection. J Chromatogr,1991, 545 (2): 445
 5 吴惠芳, 关福玉, 罗 毅. 高效毛细管电泳分析血样尿样中巴比妥类药物. 药物分析杂志, 1996, 16(5): 316

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