高效液相色谱2

　　高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)又叫高压、高速、近代液相柱色谱，但常叫做高效液相色谱。它是20世纪60年代中期才建立的一个高效快速分离化合物的方法，只是到了70年代后期才广泛地用在生物大分子的分离和纯化方面。在分离生物大分子时HPLC与经典的柱液相色谱比较具有以下几个优点：①分辨率高。一根长10cm的柱子可以分离十几种以上的物质。②速度快。物质的分离与纯化一般在1h内就可以完成，甚至只需要几分钟时间，其流速一般为1～10ml／min或更高。③重复性好。HPLC在分析生物大分子时结果误差小于5％。④适用面广，灵活性强。几乎所有的生物大分子根据它们的性质差别(等电点、疏水性、相对分子质量、电荷分布等)都可以使用不同的HPLC方法进行分离提纯，在一定的条件下，还可以保持其高的生物学活性，且极易回收。⑤灵敏度高。HPLC已广泛采用高灵敏的检测器，加上仪器本身集分离和富集于一身，使生物大分子的最小检测下限非常低。这些HPLC特有的优点，使它在近年生物大分子的分离和纯化方面占据了极其重要的地位。
　HPLC在分离生物大分子时同经典色谱一样，按照分离机制，可将其分为：高效离子交换色谱(high performance ion―exchange liquid chromatography，HPIEC)、高效反相色谱(high performance reversed―phase liquid chromatography，HPRPC)、高效疏水作用色谱(high performance hydrophobic interaction liquid chro―matography，HPHIC)、高效排阻色谱(high performance size exclusive liquid chromatography，HPSEC)和高效亲和色谱(high performance affinity liquid chromatography，HPAC)等几种。

　　一、高效液相色谱仪
　　高效液相色谱仪是20世纪60年代后期发展起来的一种分析仪器。高效液相色谱设备中的基本部件是输液泵、色谱柱和检测器。但为了能得心应手地工作，仪器应当适应多功能的要求，同时配有梯度装置、部分收集器、恒温系统、数据处理系统以及控翻统等部件。

　　1．贮液装置 贮液装置是用来贮存足够数量的洗脱液，供分离物质之用。
　　2．输液泵 泵是HPLC设备中重要的部件，是驱动溶剂和样品通过色谱分离柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。
　　3．梯度洗脱装置 梯度洗脱是利用两种或两种以上的溶剂，按照一定时间程序来改变配比浓度，以达到提高洗脱能力、改善分离效率的一种有效方法。梯度洗脱技术在高效液相色谱分离生物大分子中有很重要的实用价值，特别在分离多组分的生物大分子样品时，各组分的k值相差很大，很难用一种固定配比浓度的溶剂获得良好的分离，无法将各组分的k值都控制在有效的范围内。采用梯度洗脱可以按一定程序，改变溶剂的极性和洗脱强度，使各组分k值均可控制在最佳条件，不但能提高分离效果和改善峰形，而且可缩短分析时间。梯度洗脱中，后被洗脱的组分比它在相应的等浓度洗脱中的峰形更尖锐，因此检测的灵敏度更高。
　　4．色谱柱 色谱柱是HPLC的核心部件，要求分离度高，柱容量大，分析速度快，而这些性能不仅与柱填料有关，也和它的结构、装填、使用技术有关。
理论上，色谱柱越长，柱的分离效果越好，但由于固定相的粒度对柱长产生了限制，在目前的条件下，只能保证10 ~ 25cm长的柱子可获得好的重现性和结果。色谱柱的内径国外常采用4．6mm。国内常采用5mm。随着色谱技术的发展，内径2mm的色谱柱已作为常用柱径，因为，它可以获得与粗径色谱柱基本相同的分离效果，而其溶剂的消耗量仅为5mm柱子的1／6。
　　5．进样器 待分析样品从柱前的进样器进样，可用注射器进样、阀进样和自动进样器进样三种。其中注射器进样和阀进样最为常用。
　　6．检测器 被分析的组分从柱子流出以后该组分在流动相总的浓度的变化可通过检测器转化为电信号或光信号而被检出。在HPLC中，用于生物大分子浓度检测的主要是UV检测器。近年来发展的二极管矩阵UV检测器允许对柱子流出物进行不停流的瞬间的UV波长扫描，是一个比较理想的检测器。荧光检测器有比较高的灵敏度，一般可比UV高10�1 000倍，但也有更专一的选择性。对于一些电化学活性的物质，电化学检测器是一个比较理想的检测器，它的灵敏度比UV高100～1 000倍。
　　7．部分收集器 如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了收集样品去做其他鉴定或小型制备，部分收集是经常要用的。
　　8．数据获取和处理系统 先进的高效液相色谱仪多用微处理机控制，这通常是一台专用的微型计算机，其功能有二：一是作为数据处理机，二是作为控制机。
　　二、HPLC的应用及进展
　　(一)高效离子交换色谱
　　HPIEC是蛋白质纯化中最为常用的色谱法，占各种蛋白质色谱分离技术使用量的75％左右。它是依据蛋白质与分离填料间的静电作用力不同而进行分离的一种方法。HPIEC在分离蛋白质时，由于采用的流动相为低浓度的盐水体系，使得蛋白质在分离后的活性回收率大于90％。对于HPIEC填料的选择，通常是根据流动相的pH和蛋白质的pI共同确定的。当溶液的pH>pI时，蛋白质带负电荷，在阴离子交换剂保留；当pH<pI时，蛋白质带正电荷，在阳离子交换剂上保留；当pH＝pI时，蛋白质不带电荷，在HPIEC上不保留。因此，我们可以根据溶液的pH和蛋白质pI的情况来选择不同的离子交换填料实现蛋白质的分离。HPIEC在分离蛋白质时，既可以使用pH梯度也可以使用盐浓度梯度或等浓度洗脱的方式进行分离。
　　离子交换色谱法近年人们主要侧重以下几方面的研究：
　　1．应用研究 由于HPIEC使用费用低廉，可选择的范围广，而且在纯化后蛋白质保持高的生物学活性和高的质量回收率，使得它无论是在实验室规模还是在大规模蛋白质纯化方面都表现出了良好的应用前景。目前使用HPIEC纯化的蛋白质已在千种以上，如抗胰凝乳蛋白酶抗体、基因重组糖原磷酸化酶、抗原和抗体复合物纯化等。
　　2．分离速度提高 分离速度的提高是许多分离工作者十分关注的问题。在HPIEC方面，非多孔填料的出现，使以往几十分钟才能完成的工作在几分钟之内就可以完成。非多孔填料的颗粒只有几个微米，颗粒小，色谱的穿透性能好，流速范围宽，再加上填料表面的非多孔结构，有效地避免了蛋白质在固定相内部的吸附和扩散，提高了蛋白质的质量和活性回收率。
　　另一种提高IEC分离速度的色谱填料是灌注色谱技术(peffusion chromatography)。这种色谱的填料内部具有80～150nm的扩散孔和600～800nm的贯穿孔，流动相可直接从固定相内部穿透而过，从而避免了在传统的色谱分离过程中蛋白质是靠扩散而传递到固定相内部的过程。这种技术比传统的色谱技术快10～100倍，分析一个样品只需30 s到3 min。
　　另一种快速分离蛋白质的技术是连续柱床填料(continuous bed matrix)。这类填料是柱子中直接通过化学合成方法一步制备的。柱子勿需进行装填，当使用的填料失效后，直接从柱子中将填料芯取出，换上一个新的填料芯即可，使用极其方便，而且还具有灌注色谱的特点。流动相可直接穿过固定相的内部，避免了蛋白质在分离过程中的扩散作用，分离过程快速，重复性好，可直接对分离的条件进行线性放大。
　　(二)高效疏水作用色谱
　　HPHIC因其廉价和纯化后保持高的蛋白质生物学活性而成为一个较新的蛋白质分离技术。它的分离是依据蛋白质与固定相间的疏水作用不同而进行的。洗脱体系为高浓度的盐析盐水溶液。当在高盐浓度时，蛋白质被吸附在固定相的表面，随着盐浓度的降低，蛋白质逐渐地被分离开来。
　　HPHIC是一个通用的蛋白质分离技术，它使用的流动相为高浓度的盐析盐溶液(最常用的盐体系为硫酸铵―水溶液)，对蛋白质的构象具有一定的稳定作用，所以在分离后，蛋白质可保持高的活性回收率。目前，利用HPHIC分离的蛋白质有糖蛋白、单抗、酶和基因重组蛋白质等。
　　HIC在近几年的研究重点：
　　1．新填料的合成像HPIEC一样，HPHIC的非多孔填料、灌注色谱填料和连续柱床填料相继被合成出来，这些新填料的使用大大提高了蛋白质的分离速度和分离效果。
　　2．蛋白质的保留机制 蛋白质在HPHIC上是如何进行保留的一直是HPHIC的一个主要研究方向。到目前为止，人们已经提出了许多假设，但比较完善的理论是疏溶剂化理论和计量置换模型。
　　3．基因重组蛋白质纯化和复性 目前基因重组技术表达的大部分蛋白质是在正E.coli系统中进行的。表达后的蛋白质常常形成包含体，疏水性较强，这样通过一步HPHIC的纯化就可以非常有效地除去杂蛋白而获得高纯度的蛋白质。另一方面，HIC还可适用于高浓度的盐酸胍和尿素等变性剂溶液，当表达后的蛋白质使用变性剂溶解后，可在HPHIC上直接进行分离，在分离蛋白质的同时其生物学活性也得到了恢复，因此，利用HPHIC分离基因重组蛋白质的方法倍受青睐。
　　4．蛋白质纯化工艺 在制备蛋白质产品时为了有效地减小蛋白质溶液的体积，通常使用盐析法使蛋白质沉淀下来。蛋白质在沉淀后进行分离时，又不得不使用透析方法除盐，方法比较复杂。如果将HPHIC放在盐析工艺之后，蛋白质不单可以得到好的分离，而且还可以免去除盐的烦恼。
　　(三)高效亲和色谱法
　　从1968年亲和色谱(AC)分离技术被Cuatrecasas提出至今已有30年的历史。在这30年中，亲和色谱技术得到了迅速的发展，并被广泛地用于许多研究领域中。
AC是利用配体与目标产物间进行特异性地的生物学识别作用来进行分离的一种方法。这种特异性的识别具有很强的专一性，如抗原与抗体的识别、抗原与细胞或病毒表面受体的识别、酶与底物的识别等。由于这种特异的识别过程具有很强的专一性，因此，AC对蛋白质分离具有非常好的效果，而且在许多蛋白质的分离中，亲和色谱技术已成了必不可少的分离手段。如基因重组人α�干扰素、白细胞介素�2和从尿中提取尿激酶等。
　　上述的特异吸附某一蛋白质的HPAC配体称为特异性的配体。另一类是可以吸附某一类蛋白质的HPAC配体称为通用性配体。通用性配体目前共有三类：一是组氨酸配体，它主要是用于对组氨酸有识别作用的一类蛋白质的分离，如从胎盘中提取大量的IgG；二是三嗪染料配体，它对许多蛋白质有识别作用，如使用Cibacron blue F3GA对人血清白蛋白的纯化；三是金属离子亲和配体，它是利用蛋白质与金属离子之间形成整合物而进行分离的。利用它分离的蛋白质有IgG、血液结合素以及许多基因重组的融合蛋白质。对于通用性的亲合配体最大的优点在于柱子的合成比特异性的配体合成相对容易，适用面宽，目前有现成的商品化产品出售。
　　HPAC分离技术目前已成为高效色谱分离领域中的一个重要分支，它在分离过程中表现出的高选择性和特异性是其他任何技术无法比拟的，但HPAC技术在发展中也遇到某些固有的限制，如不易在大规模生产中使用，无法直接从浑浊溶液中分离目标产物等不足。为了克服亲和色谱技术本身的缺陷，近几年人们对其进行了大量的改造使其得到了巨大的发展，相应新的亲和分离技术也不断的产生，如磁性亲和分离技术、径向亲和分离技术、膜亲和分离技术、双水相亲和分离技术、亲和沉淀分离技术、融合蛋白标签技术等。这些新技术的产生不断扩展了AC技术的应用范围。
　　(四)高效反相色谱法
　　反相色谱法是一个通用性的蛋白质分离技术。它是利用蛋白质表面的非极性区域同固定相表面的非极性配体相互作用，按照疏水作用力大小进行分离的一种方法。在分离时，HPRPC由于使用酸性极性有机溶剂作为流动相，使用疏水性极强的非极性烷链作为固定相的配体，使得蛋白质在HPRPC上进行分离时常常失去生物学活性，所以使用HPPRC进行蛋白质分离时常常受到限制。然而，有些天然的或重组的蛋白质在上述条件下不失活，或在分离后蛋白质的构象可以恢复到天然的状态，PRC则是一个非常好的分离方法。如天然或重组的胰岛素、重组的人IL�2纯化。另外一类在分离后勿需保留生物学活性的蛋白质，也常常使用HPRPC技术。在对蛋白质进行序列分析时，常常将HPPRC作为纯化的最后一步，既进行除盐又进行分离。
　　在HPPRC分离体系中，固定相的变化对分离效果影响不大。对分离效果影响较大的是流动相的组成和洗脱方式的选择。在HPPRC中，蛋白质分离常用的流动相为甲醇―三氟乙酸(TFA)―水体系、异丙醇―TFA―水体系和乙腈―TFA―水体系三种。除此之外还有甲酸―异丙醇―水体系等。蛋白质在PRC分离时的洗脱方式有梯度洗脱和等浓度洗脱，其中梯度洗脱最为常用。
　　(五)高效排阻色谱
　　HPSEC是蛋白质分离的另外一种方式，它是按照蛋白质的大小序列进行分离的一种技术。不涉及太多的作用力问题，操作简单。作为蛋白质分离的一种方法，它具有如下优点：①分离条件温和，蛋白质的活性回收率高，大部分蛋白质在HPSEC分离后的活性回收率大于90％；②蛋白质的分离是按分子的大小顺序进行分离的，不需要使用梯度分离方法，操作简单，对于未知的蛋白质在分离后就可以估算出它的相对分子质量的大小；③HPSEC是蛋白质除盐最为常用的方法，比透析方法快。但HPSEC最大的缺点在于分离容量小，蛋白质在分离时的上样体积通常为柱体积的1％左右，最大不能超过柱体积的5％。因此在分离时，通常将它放在纯化工艺的最后。由于HPSEC在分离过程中蛋白质的保留时间不会超过柱子的外水空间，所以，柱效较以上的色谱方法都低。
　　由于HPSEC是最早用于蛋白质分离的色谱技术，所以早期许多蛋白质纯化方法常常选用HPSEC技术。目前对HPSEC的研究主要是在合成填料方面，分离效果更好，耐压程度更强的填料被不断地合成出来，如Superdex系列产品。