弥漫性血管内凝血（DIC）

【实验目的】 

1. 本实验通过复制急性实验性DIC动物模型。

2. 测定几项血液学指标，观察DIC时血液凝固性变化，并分析这些变化的原因和急性DIC的发病机制。

3. 了解急性DIC的实验室检查方法。

【实验原理】 

DIC是指在某些致病因子作用下，凝血因子和血小板被激活，引起血管内微血栓形成，同时或继发纤溶亢进，从而出现器官功能障碍的病理过程。在DIC发生发展过程中，各种凝血因子和血小板因大量消耗而明显减少，纤维蛋白降解产物（FDP）增多，引起出血和器官功能障碍。

【器材和药品】 

电热恒温水箱、分光光度计、离心机、显微镜、血细胞计数板、兔解剖台、哺乳类动物手术器械、秒表、小试管架、12mm×75mm和12mm×100mm试管、刻度离心管、0.5 ml吸管、血红蛋白吸管、药物天平、1.5mm外径硅胶管。

4%兔脑粉生理盐水浸液、K试液、P试液、1%硫酸鱼精蛋白液、0.025mol/L氯化钙溶液、血小板稀释液、3%戊巴比妥钠溶液、3.8%枸橼酸钠溶液、生理盐水、饱和氯化钠溶液、5%葡萄糖（GS）溶液。

【实验对象】 

家兔，雌(未孕)、雄不拘，重2～2.5kg。

【方法和步骤】

1. 实验兔一只，称重。用3%戊巴比妥钠按1.0 ml/kg由耳缘静脉缓慢注入麻醉(每分钟不超过1毫升)。麻醉后将动物仰卧固定于兔解剖台上，必要时将实验台底面灯开亮作保温用,剪去颈部手术野的被毛，常规暴露一侧颈总动脉，插入硅胶管，作取血样本用。

2. 静脉滴注5%葡萄糖（5ml/kg），在8～10min滴完后，取4%兔脑粉生理盐水浸液，按2.0ml/Kg体重计算，将总量用生理盐水稀释至30ml，由耳缘静脉注射（可用头皮静脉针），在15min内注完。其注入速度为：第一个5min以1.0ml/min注入；第二个5min以2.0ml/min注入，最后5min以3.0ml/min注入。

3. 在注入兔脑粉浸液前5min，注入后15min及45min，分别由颈总动脉取血样本一次（每次取血样前先废弃血液数滴），抗凝剂（3.8%枸橼酸钠溶液）与血液之比为1∶9（V/V），3000r/min，离心15min，获得含微量血小板血浆作为大部分实验测定用。每次取血样本时，采血1～2滴供血小板记数用。

4. 对照兔一只，不注射兔脑粉浸液而改为注射生理盐水，注入途径，总量，速率和取血样本时间等均与实验兔相同。

5. 几项血液学检查

（1）白陶土部分凝血活酶时间（KPTT）测定

① 取被检血浆0.2ml，加入小试管内，置37℃水浴中，然后加入K试液0.2ml，混匀，孵育3min；

② 加入0.025mol/L氯化钙溶液0.2ml，同时开动秒表，10s后将试管从水浴中取出，轻轻的侧动，直至液体停止流动（呈胶冻状）或出现白色粗颗粒时，即为凝固终点；

③ 重复操作2～3次，取平均值。

（2）凝血酶原时间（PT）测定

① 取被检血浆0.1ml，置于小试管中，放入37℃水浴中；

② 加入p试液0.2ml，开动秒表，观察方法同上，测定凝固时间；

③ 重复操作2～3次，取平均值。

（3）凝血酶时间（TT）测定

① 取被检血浆0.2ml，置于小试管中，放入37℃水浴中；

② 加入适宜浓度的凝血酶悬液0.2ml，开动秒表，观察方法同上，测定凝固时间；

③ 重复操作2～3次，取平均值。

（4）血浆鱼精蛋白付凝实验（3P实验）

① 取被检血浆0.45ml，置于小试管中；

② 加入1%硫酸鱼精蛋白液0.5ml，混匀，在室温下放置30min，于观察前轻轻摇动试管，有白色纤维或凝块为阳性，均匀浑浊，无白色纤维者为阴性。

（5）纤维蛋白原定量（饱和盐水法）

① 取被检血浆0.5ml，置于12mm×100mm的试管中，加入饱和氯化钠溶液4.5ml，充分混匀，置37℃水浴中孵育3min，取出后再次混匀，用分光光度计比色，测定光密度；

② 以生理盐水代替饱和氯化钠溶液，进行同样操作，作为对照；

③ 用对照管调零点，测出光密度（波长520nm）后，按下式计算纤维蛋白原含量；

（测定管光密度/0.5）× 10 = g/L

（6）血小板记数（BPC）

吸取血小板稀释液0.38ml于一试管内，用血红蛋白吸管吸血20μl立即加入血小板稀释液内，充分摇匀后，用滴管将上述混悬液一小滴滴入计算室内，静置15min后，用高倍镜记数，数5个中方格内之血小板数×109/L即可。

【注意事项】

1. 本实验中,兔脑粉浸液的制备及注射速度对实验成败影响很大。在注入兔脑粉浸液的过程中，密切观察动物的呼吸情况，必要时酌情调整注射速度。

2. 本实验中所用试剂，血浆样本及吸管较多，同一吸管只能吸取某一试剂或血浆样本，避免交叉使用。

3. 恒温水浴中的水温应维持在（37±0.5）℃。

4. 如室温较低（20℃以下），血浆放在37℃恒温水浴中保温1 min。

 

附录：

1. 适宜浓度的牛凝血酶悬液：将牛凝血酶悬液以正常人血浆作基质，将凝固时间调至15～18s。

2. K试液：实验前将2%白陶土生理盐水悬液1份与兔脑磷脂悬液等量混合，作KPTT测定用。

3. P试液：实验前称取200mg兔脑粉，加入5ml生理盐水，重复混匀后放入37℃水浴中孵育1h，在此过程中，间歇用玻棒搅拌3～4次，并颠倒混匀，然后离心（1000r/min）5min，吸取上清液，再加入等量的0.025mol/L氯化钙溶液，用前摇匀，作PT试验用。

4. 1%硫酸鱼精蛋白液：取硫酸鱼精蛋白1g,用生理盐水配制成100ml,再以2%碳酸钠溶液调pＨ至6.5，用滤纸过滤后，置普通冰箱保存备用（或用市售1%鱼精蛋白注射液）。