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HLA细胞法分型试验总结

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HLA细胞法分型试验是临床医学检验技士/技师/主管技师考试复习需要了解的检验基础知识,医学|教育网搜集整理了相关内容与考生分享,希望给予大家帮助!

HLA-D和DP位点的抗原须用细胞法分型进行鉴定,所以又称LD抗原(lymphocytedefinedantigen),其鉴定方法普遍采用混合淋巴细胞培养(mixedlymphocyteculture,MLC),也称混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)。

1.试验方法将分离的反应细胞(通常是患者的淋巴细胞)与刺激细胞(通常是供者或已知的标准淋巴细胞)配制成1×106/ml浓度的悬液,各加0.2ml到反应管中;放置37℃和5%CO2环境下培养5~6天。培养结束后进行涂片染色,观察并计数转化的淋巴细胞;也可在培养结束前5~12小时加入3H-TdR,收获后用液体闪烁仪计数细胞的放射性。试验结果的常用表示方式是刺激指数(SI)。

MLC分为双向法和单向法。双向MLC是反应管中两种细胞都有应答能力,可以互为刺激细胞和反应细胞,试验结果是两种细胞反应之和。

SI=2×试验管cpm/(A对照cpm+B对照cpm)

双向MLC只能反映两种细胞间LD的差别,结果比较模糊,也不能做LD抗原的分型。单向MLC是将刺激细胞用丝裂霉素C(mitomycinC)或X线照射先行灭活,但细胞的抗原性保持不变,因此可作为刺激细胞而不能作为反应细胞,试验结果是待检测细胞的反应,使于结果分析。

SI=试验管cpm/自身对照cpm

单向MLC可以用来进行HLD-D和DP位点的分型试验,常用的方法有两类:纯合子分型细胞(homozygoustypingcell,HTC)试验和预敏淋巴细胞分型(primedlymphocytetyping,PLT)试验。

2.HTC试验HTC是指细胞内一对同源染色体上两个HLA单倍型完全相同,所以该位点在细胞表面只表达一种抗原;HTC可从近亲婚配的子代表中寻找。将一组HTC经处理来活后作为刺激细胞,与待检细胞做单向MLC.如果待检细胞与刺激细胞的LD不同,就会发生反应;如果相同便不反应;所以试验又称为阴性分型法医学|教育网搜集整理。当SI≤2时可认为待检细胞与该管HTC的LD抗原相同。本法的缺点是HTC难以得到,而且培养时间长(5~6天),在尸体器官移植时不能应用。

3.PLT试验本方法需事先准备分型细胞:选择只有一个单倍型相同的两个体a/b和a/c(这在双亲与子女之间不难做到),取前者的淋巴细胞处理后作刺激细胞,取后者的淋巴细胞作反应细胞;将两者进行单向混合培养,至第10天使可得到针对b单倍型有特异性免疫应答能力的预致敏分型细胞(PTL)。依此类推,可以制备出一系列能识别各种已知LD抗原的一套PTL;这些处于休止状态的致敏记忆细胞可在液氮中长期保存备用。

进行PLT试验时,需将待检淋巴细胞处理成刺激细胞,而PTL为反应细胞;如果待检细胞的LD抗原与PTL预先识别的特异性相同,则PTL会迅速出现反应(二次应答),如不同则不出现快速反应,所以本法又称为阳性分型法。PLT法克服了HTC法试验周期长的缺点,在24小时内即可报出结果医学|教育网搜集整理;PTL比HTC容易得到,但真正做起来也复杂。

不管是CDC试验还是MIC方法,都必须以受检者的淋巴细胞作为检测标本,这就大大地限制了检测方法的应用范围;而且还存在抗体来源困难、细胞培养周期过长等缺点;所以近年来将分子生物学技术引入了HLA检测的领域,产生了DNA分型法。DNA分型法是利用PCR技术将标本中的少量目的DNA大量扩增,然后再进行产物鉴定的方法(原理和步骤在此不予讨论),特点是灵敏度高,试剂来源容易,应用范围广,陈旧的或微量的标本都可进行检测,在移植医学、法医学和其他方面都有广阔的前途。

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