斑马鱼快速检测类过敏反应方法的建立及其应用

中药注射剂和药用辅料引起的类过敏反应已经成为药物质量控制中遇到的一个严重问题，但目前的还缺乏能够快速、准确、可靠地大规模进行类过敏反应检测的方法。体外实验虽然快速、高效，但是检测结果的预测准确性不高；哺乳动物实验跟人体的实验结果相关性较好，但是很多观察指标无法定量，只能定性观察，实验操作人员个人技术水平和经验等主管因素会对实验结果产生干扰。

本研究利用斑马鱼，建立一种体内类过敏快速检测模型，并利用此模型，检测药用辅料吐温80及其杂质（氯乙醇、乙二醇和双氧水）的致敏性。与过敏反应（也叫Ⅰ型变态反应）不同，类过敏反应不需要IgE介导的二次致敏，可以由外源性致敏物质直接诱发，且类过敏反应发生与否跟致敏物质的量有直接的关系。在类过敏反应中，外源性物质首先激活肥大细胞——肥大细胞脱颗粒，肥大细胞激活后会释放出组胺、类胰蛋白酶、C3、白三烯等活性产物，进而诱发下游的过敏反应。类胰蛋白酶是肥大细胞激活后释放的代表性物质之一，类胰蛋白酶的水平可以检测反应肥大细胞是否被集火。经过深入研究，我们建立了一种用斑马鱼体内快速类过敏反应的方法。

具体方法阐述如下：
N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐（BAPNA）是类胰蛋白酶的底物，被类胰蛋白酶水解后会显色，可以在405 nm处检测光吸收值（OD）值。用已知能够诱发类过敏反应的化合物C48/80作为阳性对照，我们对斑马鱼的发育阶段、每个检测组的斑马鱼数量、检测底物的浓度等进行了优化，最终建立基于微孔板分析的斑马鱼类过敏反应快速检测模型。随后，我们进行了病理组织学验证，病理组织切片结果表明凡是能够诱导类胰蛋白酶水平大量增加的物质，均能诱发斑马鱼肥大细胞脱颗粒，证实了基于微孔板分析的斑马鱼类过敏反应快速检测方法的可靠性。

斑马鱼类过敏反应快速检测方法，我们评价了国内外不同厂家的总计十个不同批次的Tween-80样品以及Tween-80生产过程中主要杂质。结果显示，有三个批次的Tween-80能诱导斑马鱼类过敏反应，且呈现显著地浓度依赖性，有明显的致敏性；其余七个批次的Tween-80不诱导斑马鱼类过敏反应；实验结果与在beagle犬上进行的实验结果具有很好的一致性。同时，我们也发现，在Tween-80生产过程中所产生的杂质中，乙二醇（(ethylene glycol）和2-氯乙醇（2-chloroethanol）均不诱发类过敏反应，而过氧化氢（hydrogen peroxide）能够显著诱发类过敏反应，具有很强的致敏性。相关工作成果最近在Journal of Applied Toxicity杂志在线发表（Tween-80 and impurity induce anaphylactoid reaction in zebrafish）。

由于具有快速、高效、可靠、成本低以及能够进行体内定量评价等优势，相信斑马鱼类过敏反应快速检测模型非常有希望成为中药注射剂和药物辅料类过敏反应检测的一种生物学质量控制标准。