血小板基因结构和基因分型

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一、血小板特异性抗原的等位基因结构和血小板糖蛋白复合物多态性血小板膜上具有多态性的血小板糖蛋白复合物是血小板特异性抗原的载体，至少5个膜糖蛋白：GPIa，Ib（α和β），IIb，IIIa和CD109是多态性，携带着HPA同种特异性抗原。大多数携带特异性抗原的糖蛋白是二聚体复合物，由两个不同的糖蛋白分子配对组成，如GPIa/IIa，IIb/IVa或Ib/IX糖蛋白复合物，只有CD109是单体结构，CD109上的HPA-15a，HPA-15b抗原都有相当高的频率。血小板特异性抗原在糖蛋白上的位置，所在的染色体，以及编码的等位基因，形成多态性的DNA上碱基对的替换和造成相应氨基酸的改变，详见表1血小板特异性抗原（HPA）基因资料。

表1 血小板特异性抗原（HPA）基因资料
 

 

血小板抗原	所在糖蛋白	编码基因	染色体位置	核苷酸改变	氨基酸改变
HPA-1	GPⅢa	ITGB3	17	176T>C	L33P
HPA-2	GPⅠba	GP1BA	17	482C>T	T145M
HPA-3	GPⅡb	ITGA2B	17	2621T>G	1843S
HPA-4	GPⅢa	ITGB3	17	506G>A	R143Q
HPA-5	GPⅠa	ITGA2	5	1600G>A	E505K
HPA-6	GPⅢa	ITGB3	17	1544G>A	R489Q
HPA-7	GPⅢa	ITGB3	17	1297C>G	P407A
HPA-8	GPⅢa	ITGB3	17	1984C>T	R636C
HPA-9	GPⅡb	ITGA2B	17	2602G>A	V837M
HPA-10	GPⅢa	ITGB3	17	263G>A	R62Q
HPA-11	GPⅢa	ITGB3	17	1976G>A	R633H
HPA-12	GPⅠbb	GP1BB	22	119G>A	G15E
HPA-13	GPⅠa	ITGA2	5	2483C>T	T799M
HPA-14	GPⅢa	ITGB3	17	1909_1011delAAG	K611del
HPA-15	CD109	CD109	6	2108C>A	S703Y
HPA-16	GPⅢa	ITGB3	17	497C>T	T1401
HPA-17	GPⅢa	ITGB3	17	662C>T	T195M
HP1-18	GPⅠa	ITGA2	5	2235G>T	Q716H
HPA-19	GPⅢa	ITGB3	17	487A>C	K137Q
HPA-20	GPⅡb	ITGA2B	17	1949C>T	T619M
HPA-21	GPⅢa	ITGB3	17	1960G>A	E628K

 

二、HPA基因分型方法对HPA表型分型，由于难以获得高质量，特异性的HPA抗血清，而且目前用于的HPA分型的可靠血清学试剂比较稀有，所以很难系统确定HPA表型型别。随着分子生物学技术的发展，目前对HPA的分型主要是进行基因分型，基因分型技术成熟，广泛被各实验室运用于基因型别的筛查和建立已知HPA基因型的血小板供者库，以下是当前比较多使用和探讨的基因分型方法；

1、聚合酶链式反应序列特异引物分型技术（PCR-SSP）：1993年，Metcalfe等首次运用序列特异性引物PCR成功地对HPA-1进行分型。PCR-SSP的原理：设计特异性引物，利用引物3‘端的特异性，直接扩增相应的HPA片段，PCR产物凝胶电泳以后，以紫外线透射来检测，DNA条带的存在或缺失即可确定基因型。特点：PCR-SSP操作比较简单，耗时较少，适合小批量标本，是目前HPA基因定型中最常用的一种技术。

2、实时定量PCR原理：在PCR指数扩增期间，利用连续检测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。它广泛应用于定量检测mRNA表达水平，其特点是易操作、高通量、敏感性高和特异性强。最近，Ficko等运用实时定量PCR技术分析了血小板糖蛋白GP-Ⅲa基因的表达。

TaqMan技术是美国PerkinElmer公司研制的一种实时PCR技术，它利用了Taq多聚酶的核酸酶活性。Taq酶在引物延伸过程中，特异性移去杂交的探针，利用其5‘核苷酶活性将探针启开，释放出指示荧光染料，指示染料的荧光强度随着每一个扩增循环而增加。这一方法成功运用于HPA-1、HPA-2和-3基因定型。

3、基因芯片技术（DNAmicroarray）

利用正向杂交的方法，制成针对HPA基因SNP位点的DNA芯片；用荧光标记的HPA型特异性探针分别于芯片进行杂交，用软件分析样品的杂交结果，从而确定样品的HPA基因型。此技术特点是一次性可同时检测大量样品、快速、准确。近来，Brès等用基因芯片对HPA-1等位基因系统分型，证明此方法适用于HPA基因分型。

4、限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）原理是限制性内切酶能够识别DNA序列上的特异性位点，并切割产生一定长度的DNA片段。相应基因片段用含SNP区域的引物进行扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，最后在紫外线下进行DNA片段的带型分析。该法特点是RFLP是利用限制性内切酶酶解相应位点口增产物，不需探针杂交，但被测的HPA基因需有合适的限制性酶切位点。

5、聚合酶链式反应—等位基因（序列）特异性寡核苷酸杂交（PCR-ASO）该方法用PCR扩增SNP的基因序列，扩增产物连接到尼龙膜支持物上，再与标记的等位基因特异性的指示物—寡核苷酸探针杂交。该方法特点是以杂交为基础的检测技术，但需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。

6、同源双链优先形成试验（PCR-PHFA）原理：双标记扩增产物（标准双联DNA，它的两条链分别被生物素和邻苯二甲酸二壬酯（DNP）标记与未标记的待测DNA双链之间杂交时的竞争。该方法特点：不需要电泳，可用软件进行结果判读。

7、单链构象多态性分析（PCR-SSCP）其原理是单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率与其分子大小和三级构象有关，依次来检测基因突变和多态性。

8、血小板基因序列检测方法（HPA-SBT）原理：通过对DNA碱基序列的检测和比对，进行血小板基因分型和鉴定，是最有价值的血小板基因分型方法之一。