免疫分析中干扰物的排除-检验技师

近十几年，国内外报道了免疫分析中的假阳性、假阴性或其他的特异性干扰，尤其对双抗体夹心法测定干扰明显。干扰物有：血浆、血清蛋白（类风湿性因子、结合蛋白）、嗜异性抗体（Id）、人抗动物抗体（HAAA）和药物及其导致的代谢物等，尤其是后两种抗体干扰最多。

随着鼠源性单克隆抗体（鼠McAb）应用于免疫显像及免疫治疗，使患者产生人抗鼠抗体（HAMA）。而人在与宠物的接触中也易产生HAAA.注射疫苗及患腹腔疾病时，食物抗原也会产生HAAA.HAAA和HAMA的存在使免疫分析容易产生假阴阳性。一旦假阳性或假阴性的结果没有被发现，患者将要承受不必要的治疗及身体和精神上的痛苦。因而，鉴定和排除这些干扰物成为当务之急。

1、嗜异性抗体的干扰

嗜异性抗体（Id）是由低纯度抗原引起的，又称之为对非特异性抗原产生的抗体应答。1980年发现了Id对AFP的干扰。它是一类结合力弱的抗体，分为天然抗体和自身免疫抗体。前者又分为天然多特异性抗体、独特型抗体和类风湿性因子（RF）。天然Id是干扰物的主要来源。

天然抗体结合力弱，具有多特异性，普遍存在于人体中，多为IgG.它识别多种化学结构和自身抗原。推测它是由体细胞突变导致抗体高变区的多样化而产生的。一旦抗原侵入免疫系统，则诱导体细胞突变，产生各种非特异性的抗体。随着抗原促进细胞分化，体细胞突变以高频率进行，产生高特异性的抗体。像RF一类的抗体比天然抗体更多的体细胞突变。天然抗体中的独特型抗体能和抗原结合又能和抗体结合的高变区，因此，它能和一些多特异抗体结合。当血清含有它们时，其结合大大增加，并出现Fab-Fab二聚体状态。医学教育网|搜索整理

2、人抗动物抗体的干扰

HAAA有IgG、IgA、IgM和IgE属，可分为抗独特型和抗同种型，有多种动物IgO抗兔、抗山羊抗体作为免疫分析的第二抗体。由于不同动物Ig分子间蛋白质序列有大量同源性，因此多种动物Ig之间会发生交叉反应。

HAAA可由医源性和非医源性因素引起。前者是人体免疫系统对药用性蛋白的正常应答。动物身上可得到的药剂非常多，如：鼠McAb的靶向性药物或成像剂、马抗毒素和抗胸腺细胞Ig、羊抗地高辛Fab、嵌合抗体和胰岛素等。另外还有输血和接种疫苗等途径。它们的存在会对体外的免疫分析产生干扰，也会使治疗抗体失活和干扰小鼠McAb治疗和成像。

3、嗜异性抗体与HAAA的干扰

Prince等提出双位点免疫分析的干扰机制，更多的干扰现象被揭示，干扰机制也有了很多的假设。首先Id的干扰具有广泛性，HAAA的干扰呈现出上升趋势；其次与多克隆抗体（PcAb）一样，McAb的分析中也存在着干扰；许多干扰因素对一种分析方法有影响，而对另一种分析方法没有影响。

在双位点免疫分析中，血清中的HAMA能够非特异性桥联捕捉抗体和示踪抗体而导致假阳性，而假阴性是由于HAAA与捕捉抗体、示踪抗体其中之一结合，使它们不能与分析物结合。Id的干扰机制和HAMA类似。形成Fab-Fab结构。另外分析用抗体Fc片段也会和干扰抗体结合形成干扰物。Id和HAAA的干扰，在竞争性结合分析中很少报道，可能是由于抗原和抗体间的高亲和力，使得HAAA很难与抗原竞争，但当HAAA浓度很高时，也同样造成了干扰。

4、干扰物的鉴定

鉴定干扰物的方法：采用另一种系列的分析方法重新测量样品，如果干扰物是由独特型抗体间的互补反应所引起的，那么不同的双位点分析方法得出的结果是大相径庭的。此外，阻断剂也可用于鉴定干扰物，通过添加阴断剂导致值的改变是“干扰物存在”的一个假设性证据。采用一系列浓度梯度的阻断剂，可以防止具有高浓度的Id或HAAA的患者超过试剂的阻断能力。临床实验室鉴定干扰物也可采用高浓度的动物混合血清做稀释试验，当稀释样品后，测出的值不成比例说明存在干扰物。

此外，HAMA试剂盒有：ImmuSTRIPHAMA、EFI-HAMA、HAMA-ELISAmedac、HAMARIA、IdealHAMAELISA及EnzygnostHAMA，它们不仅检测是否存在干物，又能起监测注射动物源性制剂引起的并发症。

5、干扰物的排除

Id和HAAA的干扰机制相似，均为桥联捕捉抗体和示踪抗体，所以二者消除干扰的方法也类似。但HAAA能与特定的分析抗原竞争，且与分析用抗体的结合力稍强，因动物源性抗体使用越来越广泛，因此它产生的干扰程度也较大，比Id的干扰更多特异性和弱结合力。影响因素包括性别、年龄、生活习惯（吸咽）和自身免疫性疾病等。

5.1预防在患者接受动物源泉性抗体治疗前、中和后期，给予免疫抑制剂，如：环孢霉素、脱氧精胍菌素和环磷酰胺，即可大量阻止HAAA的产生，减轻动物源性抗体药品产生的负反应。这些免疫抑制法适用HAAA引起的干扰，对Id效果甚微。

5.2抗体的处理去除抗体片段：由于HAAA能与分析用抗体中的Fc片段结合，Id能与分析用抗体的F（ab′）2与Fc结合，去除Fc可减少干扰物，降低动物源性Ig制剂的免疫原性。采用木瓜蛋白酶处理Ig去除Fc要比胃蛋白酶的效果更好。但是Id具有弱结合力，因此该方法对Id的干扰只能有限地减少。人源化抗体：用基因工程制备人源化嵌和抗体，通过将鼠Ig与人Ig的基因片段有序结合，得到低免疫原性的缺本，但要注意，它会诱导抗体产生人抗人抗体，而引起更多的麻烦。PEG的使用：即在大分子表面（如McAb）用水溶性PEG或mPEG包被，也能大大降低McAb的免疫原性。

5.3热处理和其他目前不太主张用热或酸处理来灭活血清中的干扰物，因为大多数的分析物都不稳定，该方法曾用于CEA和CA72-4干扰物的处理。采用吸附在氟乙烯表面的鼠McAb、固相结合在琼脂糖凝胶珠上的蛋白G、蛋白A、三氟乙酸沉淀法、巯基试剂法、阳离子交换剂和亲和层析等方法，均对消除干扰物有一定效果。

5.4阻断剂的使用阻断剂包括非免疫Ig、PcAb、联合IgG、非免疫鼠McAb.又可分为非特异性和特异性两类。目前已经有商品化的阻断剂如：IIR、NS-ABT、HBR、Heteroblock、MAB33及polyMAB33.将它们加入稀释液或预处理的样品中，通过非特异性和特异性阻断剂与干扰物的结合达到减少干扰。消除干扰的效果由干扰物的浓度、类别或亚类，以及阻断剂的类别和亚类决定。

5.4.1非特异性阻断剂非特异性阻断剂一般是制备分析用正常动物血清Ig，它是多种蛋白的混合物，尽可能多地吸收Id.如果分析用抗体是不同种属，可用其中任何一种作为非Ig.若分析用抗体是同一种属（鼠类），建议添加小牛Ig作为阻断剂。非Ig的用量仍在讨论中。有建议用1%正常动物的血清为宜，但也有报道说此浓度不足以排除干扰物。商品化试剂中MAK33、MAB33等属于这类，MAK33必须热处理（60℃，10min）并配以小牛血清才有明显的效果。推测MAK33在高温条件下聚集形成巨大复合体，结合位点的增多使得Id大量结合，减低干扰。

5.4.2特异性阻断试剂特异性阻断试剂是特异针对人Ig的。如IIR、HBR等。IIR是一种由Id和HAAA为免疫原产生的混合的鼠McAb，由于它与HAAA有较高亲和力（109L/mol），所以作为阻断HAMA的特异性试剂。HBR是鼠抗人IgM的McAb，在常规阻断过程中，消除干扰的效果依赖于HAMA和它之间的结合常数（通常为106L/mol）。由于它俩的高度结合力，在一些分析中的阻断能力强于非特异性阻断剂。特异性阻断剂与非特异性阻断剂都不能完全排除干扰物，但前者能对IgM引起的干扰更有效些，而后者尤其小牛血清能够阻断特异性试剂所不能阻断的干扰抗体。

5.5实验方法的改进针对以上讨论及自身体会，提出以下几点改进意见：（1）分析用抗体采用不同种属，如一株McAb、一株PcAb，使用与治疗用抗体相同属的抗体或使用PcAb作为阻断剂。（2）在缓冲液中加入正常动物血清，它们能对Id有高亲和力。（3）样品中的干扰存在瞬时性，时有时无，注意避开其干扰峰值，建议采用重复测量。（4）双位点检测中推荐使用两步法测量，且在第一次洗板后加入阻断剂。（5）对干扰样品作单独处理，同时将干扰物测出。

Id与HAAA的干扰作用对免疫分析结果的准确性是一个很大的威胁，应该引起实验人员及临床医生的高度关注及更多地了解患者的治疗情况及生活习性，如是否有过动物源性制剂治疗，是否饲养宠物等。实验室应证实干扰物的存在范围及程度，及时将信息反馈给临床工作者，充分建立两者的联系和交流。厂商在研制试剂盒时，也应采用配套措施以减少干扰物，如提供阻断试剂，在商品包装中加注提示，存在干扰物及分析值仅供参考等字样。（作者：黄飚，唐炜，金坚）