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支原体感染的实验室诊断

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在性传播疾病中,支原体感染与非淋菌性尿道炎的发生密切相关,也可引起前列腺炎、附睾炎、不育及妇女上下生殖道的炎症等。根据国内目前实际情况,现介绍常见的3种支原体,即 解脲脲原体(解脲支原体,Uu)、人型支原体(Mh) 和生殖支原体(Mg)的实验室诊断。

一、解脲支原体(Uu)感染的实验室诊断:
  (一)分离培养方法
    Uu在含95% 氮气和5%CO2 环境中生长良好。其生长最适pH为5.5-6.5,最适温度为36℃-37℃。Uu具有尿素酶,能分解尿素产氨,使含酚红指示剂的Uu液体培养基pH值上升,颜色由黄色变为红色。再将液体培养物转种到Uu固体培养基上,能生长成具特征性油煎蛋样集落。
    (1 )液体培养基:支原体肉汤培养基80mL,马血清或小牛血清10mL,酵母浸液10mL,
10 %尿素溶液0.5mL-1.5mL, 0.4%酚红溶液0.5mL,青霉素(使其在培养基中的浓度为500U/mL-2000U/mL,)用1N HCl 调pH值至5.5-6.5, 用小试管分装后置冰箱中备用,每管1.5-2.0mL。
    (2 ) 固体培养基:在100mL 支原体肉汤培养基中,加入琼脂1.2-1.4g, ,高压灭菌后冷却到 50 ℃左右,逐一加入上述添加剂。摇匀,倒入无菌平皿中,待凝固后,置冰箱中备用。
    接种标本后,经孵育,若培养基发生由黄变红的颜色变化,透明无混浊(有别于某些细菌及 真菌生长)则可初步判断为有支原体生长。大多数Uu在24h内可获得阳性结果。如果培养基发生颜色变化,但液体又有混浊,则应排除杂菌污染, 可用0.45μm滤膜过滤后,作再接种观察。进一步诊断需将液体培养物接种到固体培养基上培养, 经Dienes法染色后在低倍显微镜下观察集落形态。阴性结果最好观察5天。Uu 在固体培养基上集落核心呈粗颗粒状,具极窄的边,有时呈油煎蛋样。如用 Dienes 法染色,集落为特异的蓝色。一般细菌的菌落不着色,容易鉴别。
    (二)代谢抑制试验
     根据特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢这一特性,可用病人血清进行代谢抑制试验。在加有抗血清的培养基中,支原体的代谢受到抑制,从而阻止了培养基的颜色改变。
    代谢抑制试验也可用于检测感染支原体患者血清抗体的滴度。即将血清作10倍连续稀释后,滴入支原体培养液,并以不加血清的支原体试验管和不加支原体液的培养基管作对照。经37℃培养,不加抗血清的培养管支原体应生长良好,培养基变成红色(Uu或Mh),未加支原体液培养基管颜色不变。未发生颜色变化的最高血清稀释度为代谢抑制试验的抗体滴度。
    (三) 间接血凝试验
    在一定条件下,抗体和相应抗原相遇,可形成抗原抗体复合物。这种复合物分子团很小,不能形成肉眼可见的反应。用经鞣酸处理的红细胞作载体,将抗原吸附在其表面,使红细胞致敏,待与相应的血清抗体相遇时,可出现肉眼可见的凝集现象。
    (四)生长抑制试验
    特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢。用直径为6mm-8mm的圆形灭菌滤纸片,以未稀释抗血清浸透后放入无菌平皿内,于4℃下干燥后待用。 吸取待检菌液0.5mL涂布于固体培养基上,置37℃使琼脂表面稍干燥。以无菌操作镊取抗血清纸片放于琼脂表面,培养4日-5日后,在低倍显微镜下观察滤纸片周围有无支原体生长。若滤纸片周围无菌落生长,出现抑菌圈大于2mm者表示该支原体与抗血清系同种免疫原,小于2mm判为异种。

 


    (五)分子生物学诊断方法
    目前主要应用聚合酶链反应(PCR)法及DNA探针技术作诊断。前者具有高度特异性和敏感性、且快速、简便。但操作要求极为严格。
    聚合酶链反应的原理是DNA片段扩增,其中支原体引物的选择是PCR检测技术中的关键。1991年Willonghby 设计的引物来自脲酶基因。Zheng等(1995)用MB抗原基因引物对所有14个血清型的Uu均显示良好的PCR扩增效果,其敏感性较Willonghby设计的脲酶基因引物更好。

 

 

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