免疫细胞的检测方法

互联网2015-01-05

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用体外或体内试验对机体的各种参与<a target="_blank">免疫</a>应答的细胞进行鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的<a target="_blank">免疫</a>状态，并对某些临床疾病的诊断，预后及疗效观察等也具有一定意义。�

一、免疫细胞的分离�

体外测定免疫细胞首先要从外周血或淋巴组织中分离所需的细胞。其主要方法是根据细胞的表面标记、理化性状及功能等方面的差别进行设计。常用的方法有密度梯度离心法辅以花环沉降或亲合板粘附法(panning)等。目前最先进的方法是用荧光激活细胞分离仪(fluorescenceactivited cell sortor，FACS)可自动、快速和大量地分出各类纯度高、活性强的细胞。�

(一)外周血单个核细胞的分离

图18.7 淋巴细胞分离(Fieoll密度梯度法)

主要方法为聚蔗糖泛影葡胺分层液(ficoll hypaque)密度梯度离心法。分离人外周血单个核细胞时，通常将分层液的比重配成1.077，肝素抗凝血置分层液上，于水平离心机2000r/min离心20分钟，血液中各种细胞因比重不同而被分开(见图18.7)。此外，分层剂还可选用Percoll、Metrizamid及牛血清白蛋白(BSA)等。分离不同动物血中单个核细胞时，对分离液比重的要求各不相同，如小鼠为1.088，大鼠为1.084，马为1.090等。�

(二)T、B及其他免疫细胞的纯化�

经密度梯度离心法获得的单个核细胞是不均一的细胞群，还可根据各种细胞的生物学特性、表面标记等进一步纯化。例如单核细胞等具有粘附和吞噬作用，可用玻璃或塑料容器的粘壁法和吞噬羰基铁颗粒的||磁铁吸引法除去或获得。绵羊红细胞能与人T细胞形成E花环，藉此可通过花环沉降法分离T与B淋巴细胞。此外，利用B细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，也可将T和B细胞分开。

为了进一步除去细胞悬液中个别细胞群，尚可将相应的单抗结合于塑料板上，利用亲和层析的原理作亲和板粘附法，或在细胞悬液中加入单抗和补体，以特异性地破坏相应细胞，使获得的细胞悬液更加均一。�

(三)免疫磁珠分离法�

近年来免疫磁珠法应用较多，基本方法是将特异性抗体标记在磁性珠上，当细胞与标记了特异性抗体的磁珠混合后，两者发生结合，置于磁铁上，吸取上清中的细胞，即可将所需的细胞分离出来。�

(四)荧光激活细胞分离仪分离法�

是将荧光标记的抗体与细胞悬液混合后装入样品管内，经荧光染色后通过高速流动系统使细胞排成单行，一个个地流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，经超声系统振荡搅动液流，使液流断裂成一连串均匀小滴，每小滴最多含一个细胞，在激光束照射下产生荧光和散射光，经光电倍增管接收，转换成脉冲信号，经电脑处理分辨细胞类型。借助光电效应，当小滴通过电场时可出现不同偏向，即可收集到所需类型的细胞。该仪器能以||5000个细胞/秒的速度高效分离细胞。FACS是集多项功能于一体的细胞分析仪器，除计数细胞外，还可通过荧光染色检测细胞表面标记、细胞增殖周期、区分细胞活性、分选细胞等。