消除胆红素对肌酐测定的负干扰方法比较

互联网2015-01-05

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测定血清肌酐（简称 cRT）的 jaffe氏法已经沿用了100多年，至今仍然被广泛地应用，然而对肌酐的显色并不特异。血清中能与碱性苦味酸反应的物质还有蛋白质、葡萄糖、抗坏血酸、丙酮、α-酮酸等。这些“假肌酐”物质通常对肌酐测定产生正干扰。由于它们的反应速度比肌酐慢，因此利用速率法在20～100s间进行测定[1]可以使肌酐的反应占绝对优势，提高反应的特异性。尽管如此，仍旧不能克服胆红素对测定的负干扰。如何消除这一干扰，近年来国内外有人报道利用酶法和某些全自动<a target="_blank">生化</a>分析仪的特殊功能 rate-Blank或 rate-B法能够从方法学角度排除干扰，并取得了良好的效果。本文就这一问题进行回顾和评价，并对各方法进行比较。

1胆红素对肌酐测定产生负干扰的原理

碱性苦味酸速率法测定的原理是肌酐同碱性苦味酸反应形成了一种红色复合物，通常在510nm外根据测定时间（20～80s）内血清和标准液吸光度的增加量计算肌酐的含量。而胆红素在510nm处也有较强光吸收，并且在氢氧化钠的作用下，逐渐转化为620nm处有强光吸收的胆绿素，而胆绿素在520nm处只有很弱的光吸收，这样就掩盖了肌酐本身的显色反应的表现，从而使测定结果偏低，甚至出现负值。有实验证明[1]，氢氧化钠对胆红素的作用与肌酐存在与否无关；肌酐含量越低，本身的显色反应弱，相对干扰就严重。血清中的游离、结合胆红素对肌酐的动力学测定都有干扰作用。

2预处理法

预处理法主要是利用各种氧化物，使胆红素被氧化成胆绿素后再测定血清肌酐含量。加入的氧化物主要有以下几种：

2.1高铁氰化钾 OLeary和 pembroke等人[2]设置试剂1（ r1）：高铁氰化钾2mmol/L，试剂2（ r2）：氢氧化钠200mmol/L，若味酸25mmol/L，临用前按5：1配制。标本： r1： r2=20μ l：20μ l：400μ l。主波长505nm，副波长570nm。样品与 r1混合后5min再加入 r2，延滞时间60s，读数时间60s。试验证明600μ mol/L以内的胆红素对肌酐测定无影响。汪俊军等人[3]推荐含有十二烷基硫酸钠、硼酸、氢氧化钠、苦味酸、高铁氰化钾浓度分别为24、10、200、15.5、0.20mmol/L的试剂配方为临床<a target="_blank">实验室</a>自动化分析测定肌酐的试剂配方，样本与试剂体积比为3：29，其它参数：波长520nm，温度37℃，测定时间30s，延迟时间20s。汪氏认为当高铁氰化钾浓度达到0.20mmol/L时，转变1000μ mol/L的胆红素可以在前20s内基本完成。可以看出用高铁氰化钾可以较好地消除胆红素对肌酐测定的干扰，但范仲元等人[4]提出加入的高铁氰化钾的量对测定结果有一定影响。试剂中加入高铁氰化钾后，标准液的反应速率有下降趋势。血清标本反应速率在加入高铁氰化钾浓度较低时有下降，但下降比率远较标准液为小，而加入浓度较高时反应速率有明显升高，总的效果是加入高铁氰化钾后使肌酐测定结果升高，且随高铁氰化钾浓度的升高而升高。

2.2过氧化氢��过氧化物酶叶耀征等人[5]取黄疸病人血清200μ l，加入1.76mol/L过氧化氢5μ l混合，再加800KU/L过氧化物酶5μ l，充分混合后置37℃水浴15min。3000rpm离心3min后再与碱性苦味酸试剂反应测定血清肌酐。试验证明200μ mol/L以内的胆红素对肌酐测定无影响。可以看出，由于在消除胆红素过程中需要一定的水浴时间和温度，此法比较繁琐，不利于全自动生化分析仪操作。为了克服以上缺点， rajs等人[6]将该法进行改良，认为由于间接胆红素与白蛋白为非共价结合，所以过氧化氢对直接胆红素的氧化过程快于对间接胆红素的氧化，为了提高氧化效率，缩短氧化时间，将咖啡因��苯甲酸盐加入过氧化氢��过氧化物酶中，使间接胆红素从蛋白质中置换出来，37℃反应7min（多数情况下，3～5min已经足够）后，再加入碱性苦味酸试剂测定血清肌酐。用该法在 cobas mira全自动生化分析仪上证明435μ mol/L以内的胆红素对测定无影响。尽管如此，由于过氧化氢与过氧化物酶、氢氧化钠与苦味酸需临用前配制且不宜久置，所以操作上仍比较繁琐。

2.3胆红素氧化酶 lorene等人[7]利用胆红素氧化酶在肌酐测定前预处理血清样品取得了良好效果。其中胆红素氧化酶1000U/L。室温孵育15min。国内陈伟英等人[8]利用胆红素氧化酶在 cobas fARA-Ⅱ型全自动生化分析仪上也取得了类似的效果，将样品8μ l与胆红素氧化酶（200U/ml）8μ l混合，以胆红素氧化酶氧化样品中的胆红素，再加入若味酸试剂80μ l作为起动试剂，进行肌酐测定，其中保温时间90s，反应时间100s。但由于胆红素氧化酶不易获得且成本较昂贵，因此该法在国内未得到普及。