消除胆红素对肌酐测定的负干扰

互联网2014-12-26

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摘要胆红素对碱性苦味酸速率法检测肌酐的负干扰。一直是临床化学技术中学的一个棘手的问题，对临床高胆红素血症病人的肾功能观察带来很大影响。多年来，国内外不少作者报道了排除这一干扰的方法，但多是从样品预处理或试剂中加入抗干扰成分（如高铁氰化钾、胆红素氧化酶、过氧化氢——过氧化物酶）入手，最近国内外有人报道利用酶法和某些全自动生化分析仪的特殊功能Rate-Blank或Rate-B法能够从方法学角度排除干扰，并取得了良好的效果。本文就这一问题进行回顾和评价，并对各方法进行比较。

关键词：肌酐；Jaffe法；速率法；胆红素

测定血清肌酐（简称CRT）的Jaffe氏法已经沿用了100多年，至今仍然被广泛地应用，然而对肌酐的显色并不特异。血清中能与碱性苦味酸反应的物质还有蛋白质、葡萄糖、抗坏血酸、丙酮、α-酮酸等。这些“假肌酐”物质通常对肌酐测定产生正干扰。由于它们的反应速度比肌酐慢，因此利用速率法在20～100s间进行测定[1]可以使肌酐的反应占绝对优势，提高反应的特异性。尽管如此，仍旧不能克服胆红素对测定的负干扰。如何消除这一干扰，近年来，已经有许多报告。本文就这一问题进行回顾和评价。

1 胆红素对肌酐测定产生负干扰的原理

碱性苦味酸速率法测定的原理是肌酐同碱性苦味酸反应形成了一种红色复合物，通常在510nm外根据测定时间（20～80s）内血清和标准液吸光度的增加量计算肌酐的含量。而胆红素在510nm处也有较强光吸收，并且在氢氧化钠的作用下，逐渐转化为620nm处有强光吸收的胆绿素，而胆绿素在520nm处只有很弱的光吸收，这样就掩盖了肌酐本身的显色反应的表现，从而使测定结果偏低，甚至出现负值。有实验证明[1]，氢氧化钠对胆红素的作用与肌酐存在与否无关；肌酐含量越低，本身的显色反应弱，相对干扰就严重。血清中的游离、结合胆红素对肌酐的动力学测定都有干扰作用。

2 预处理法

预处理法主要是利用各种氧化物，使胆红素被氧化成胆绿素后再测定血清肌酐含量。加入的氧化物主要有以下几种：

2.1 高铁氰化钾 OLeary和pembroke等人[2]设置试剂1（R1）：高铁氰化钾2mmol/L，试剂2（R2）：氢氧化钠200mmol/L，若味酸25mmol/L，临用前按5：1配制。标本：R1：R2=20μL：20μL：400μL。主波长505nm，副波长570nm。样品与R1混合后5min再加入R2，延滞时间60s，读数时间60s。试验证明600μmol/L以内的胆红素对肌酐测定无影响。汪俊军等人[3]推荐含有十二烷基硫酸钠、硼酸、氢氧化钠、苦味酸、高铁氰化钾浓度分别为24、10、200、15.5、0.20mmol/L的试剂配方为临床实验室自动化分析测定肌酐的试剂配方，样本与试剂体积比为3：29，其它参数：波长520nm，温度37℃，测定时间30s，延迟时间20s。汪氏认为当高铁氰化钾浓度达到0.20mmol/L时，转变1000μmol/L的胆红素可以在前20s内基本完成。可以看出用高铁氰化钾可以较好地消除胆红素对肌酐测定的干扰，但范仲元等人[4]提出加入的高铁氰化钾的量对测定结果有一定影响。试剂中加入高铁氰化钾后，标准液的反应速率有下降趋势。血清标本反应速率在加入高铁氰化钾浓度较低时有下降，但下降比率远较标准液为小，而加入浓度较高时反应速率有明显升高，总的效果是加入高铁氰化钾后使肌酐测定结果升高，且随高铁氰化钾浓度的升高而升高。

2.2 过氧化氢——过氧化物酶叶耀征等人[5]取黄疸病人血清200μL，加入1.76mol/L过氧化氢5μL混合，再加800KU/L过氧化物酶5μl，充分混合后置37℃水浴15min。3000rpm离心3min后再与碱性苦味酸试剂反应测定血清肌酐。试验证明200μmol/L以内的胆红素对肌酐测定无影响。可以看出，由于在消除胆红素过程中需要一定的水浴时间和温度，此法比较繁琐，不利于全自动生化分析仪操作。为了克服以上缺点，Rajs等人[6]将该法进行改良，认为由于间接胆红素与白蛋白为非共价结合，所以过氧化氢对直接胆红素的氧化过程快于对间接胆红素的氧化，为了提高氧化效率，缩短氧化时间，将咖啡因——苯甲酸盐加入过氧化氢——过氧化物酶中，使间接胆红素从蛋白质中置换出来，37℃反应7min（多数情况下，3～5min已经足够）后，再加入碱性苦味酸试剂测定血清肌酐。用该法在Cobas mira全自动生化分析仪上证明435μmol/L以内的胆红素对测定无影响。尽管如此，由于过氧化氢与过氧化物酶、氢氧化钠与苦味酸需临用前配制且不宜久置，所以操作上仍比较繁琐。

2.3 胆红素氧化酶 Lorene等人[7]利用胆红素氧化酶在肌酐测定前预处理血清样品取得了良好效果。其中胆红素氧化酶1000U/L。室温孵育15min。国内陈伟英等人[8]利用胆红素氧化酶在Cobas fARA-Ⅱ型全自动生化分析仪上也取得了类似的效果，将样品8μL与胆红素氧化酶（200U/ml）8μL混合，以胆红素氧化酶氧化样品中的胆红素，再加入若味酸试剂80μL作为起动试剂，进行肌酐测定，其中保温时间90s，反应时间100s。但由于胆红素氧化酶不易获得且成本较昂贵，因此该法在国内未得到普及。

3 采用酶法测定肌酐

piero fossati等[9]和张厚亮等[10]利用该法测定血清肌酐，其中试剂1：N-哌嗪-N′-2-乙烷磺酸（HEPES）-NaOH缓冲液、肌酸脒基水解酶（CRTase）、尿素酶、谷氨酸脱氢酶（GLD）、异柠檬酸脱氢酶（ICD）、α-酮戊二酸。试剂2：HEPES-NaOH缓冲液、CRNase、反式N，N，N’，N’-四乙酸-1，2-二氨基环乙烷（CYDTA）。其反应原理略。

酶法测定肌酐具有操作简便、特异性好、灵敏度高、不受胆红素及多种药物影响、适用于全自动或半自动生化分析仪，不仅能测定血清，而且也可以测定尿液，是目前认为测定肌酐最好的方法，但是其价格相当昂贵，一般至少是碱性苦味酸法的10倍以上，就国内医疗水平，难以普及。

4 采用Rate-Blank或Rate-B法测定肌酐

rate-Blank法是利用全自动或半自动生化分析仪中的特殊功能（样品速率空白）来达到克服胆红素干扰的目的。所谓样品速率空白是指将样品与试剂1（氢氧化钠）混合后作为样品空白测得的反应速率，也就是样品中胆红素被氢氧化钠氧化吸光度下降的反应速率，仪器经过自动扣除这种反应速率，将胆红素的负干扰值自动补偿入肌酐与碱性苦味酸的反应中，从而达到了消除干扰的目的。Hoffman rJ、Gerhard g及Alecey v Moshkin等人[11~13]利用Rate-Blank法在Hitachi737、736、Cobas mIRA上取得了良好效果。N.O’Leary等人[1]将高铁氰化钾法与Rate-Blank法相比较发现两法有很好的一致性。

rate-B法（twin test）是利用同一反应杯在一个反应周期内进行两个试验测定的功能。如果这两个试验均为速率法时，第一个反应的速率可以自动补偿入第二个反应的速率中去。我们把血清肌酐测定过程分解为两个试验，第一个试验测定胆红素在碱性环境下被氧化引起吸光度减少的速率，第二个试验测定加苦味酸后，肌酐与苦味酸反应所引起吸光度增高以及胆红素被氧化所引起的吸光度减少的总的速率。即前者测定胆红素的干扰，通过仪器微机自动处理，后者在结果计算中自动清除这种干扰，从而利用RATE-B法达到清除胆红素对肌酐测定干扰的目的。Osselaer、Lievens及石凌波、林龙顺等人[14，15]利用该法在Hitachi717、704、747、7150分析仪上取得良好效果。

rate-Blank或Rate-B法从方法学角度克服了黄疸对肌酐测定的干扰，试剂中不加任何附属成分，操作简便，与酶法结果一致，但此法在应用过程中受到了仪器的局限性。

5 小结

近年来，国内外关于胆红素对肌酐测定的负干扰已有许多报道，总的来说，以上的方法各有千秋。预处理法由于添加了其它成分，操作不可避免地显得冗长、繁琐，另一方面因为附加成分的介入，破坏了原有反应体系，可能又会引起新的干扰。但是对于缺乏Tate-Blank或Rate-B法的生化分析仪，预处理法不失是一种很好的消除干扰的方法。而酶法测定肌酐由于价格的关系，目前只被国内少数医院接受，难以普及。我们认为各单位可以根据自己的实际情况来选择测定肌酐的方法。

来源：检验世界网