琼脂糖凝胶电泳准备手册

准备干净的配胶板和电泳槽

注意 DNA 酶污染的仪器可能会降解 DNA ，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象

选择电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个 bp 的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大 DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的 DNA 链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

正确选择凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在 0.5 ～ 2 ％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的 DNA 带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液

常用的缓冲液有 TAE 和 TBE ，而 TBE 比 TAE 有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， PH 值上升，缓冲性能下降，可能使 DNA 电泳产生条带模糊和不规则的 DNA 带迁移的现象。

电泳的合适电压和温度

电泳时电压不应该超过 20V/cm ，电泳温度应该低于 30 ℃，对于巨大的 DNA 电泳，温度应该低于 15 ℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的 DNA 带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象

DNA 样品的纯度和状态

注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的 DNA 样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的 DNA 条带迁移。在上样前不要对 DNA 样品加热，用 20mM NaCl 缓冲液稀释可以防止 DNA 变性。

DNA 的上样

正确的 DNA 上样量是条带清晰的保证。注意太多的 DNA 上样量可能导致 DNA 带型模糊，而太小的 DNA 上样量则导致带信号弱甚至缺失。 TIANGEN 公司 DNA 分子量标准每次上样 6ul 即可得到清晰均匀的条带。

Marker 的选择

DNA 电泳一定要使用 DNA Marker 或已知大小的正对照 DNA 来估计 DNA 片段大小。 Marker 应该选择在目标片段大小附近 ladder 较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。 TIANGEN 公司的 DNA Marker 条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是 Marker 的电泳同样也要符合 DNA 电泳的操作标准。如果选择λ DNA/HindIII 或者λ DNA/EcoRI 的酶切 Marker ，需要预先 65 ℃加热 5min ，冰上冷却后使用。从而避免 HindIII 或 EcoRI 酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

凝胶的染色和观察

实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（ EB ），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如 SYBR Green ， GelRed ，虽然毒性小，但价格昂贵。 TIANGEN 公司的 GeneGreen 相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统 EB 染料高 10 倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。