高耐庆大霉素肠球菌耐药性接合转移试验的方法探讨

北京市友谊医院检验科 刘志远 许淑珍 100050

　　肠球菌是医院感染的重要病原菌 [1] ，对多种抗菌药产生耐药性，而且耐药菌株不断增加，接合转移是导致肠球菌庆大霉素等耐药基因转移、耐药性播散的重要原因，深入研究接合转移试验有助于了解肠球菌耐药性的产生机理。我们研究了不同培养基和不同转移方法对肠球菌质粒转移试验结果的影响，并对接合前后菌株的耐药性进行了分析。

材料与方法

一、材料

1 ．菌株

(1) 供体菌 36 株高耐庆大霉素 (HLGR) 粪肠球菌， 15 株 HLGR 屎肠球菌， 1 株耐万古霉素 (VER) 粪肠球菌均来自北京友谊医院的临床标本，所有菌株利福平 MIC 值均小于 32 μ g ／ ml 。

(2) 受体菌 粪肠球菌 JH2-2 ( 由 Don B ． Clewell 赠送，利福平 MIC>50 μ g ／ ml ，对庆大霉素、链霉素、青霉素、万古霉素、氨苄西林、四环素、红霉素、氯霉素敏感 ) ；本实验室分离的金黄色葡萄球菌 S1106( 四环素 MIC128 μ g ／ m1) 、表皮葡萄球菌 S368( 利福平 MIC64 μ g ／ ml) 。

(3) 质控菌株 粪肠球菌 ATCC29212 、 ATCC51299 。

2 ．抗菌药 庆大霉素 (Gm) 、链霉素 (Sm) 、青霉素（ Pen ）、利福平 (Rif) 、万古霉素 (Van) 、氨苄西林 (Amp) 、四环素 (Tet) 、红霉素 (Ery) 、氯霉素 (Chl) 等标准品购自中国生物药品检定所。

3 ．培养基

(1) 普通肉汤 (NB) 牛肉粉 10g 、牛肉胨 10g 、 K 2 HPO 4 · 3H 2 O 0.58g 、 NaCl 5g ，加水至 1000ml ，高压灭菌备用。

(2) 心脑浸液粉 (BHI) 购自 BBL 公司。

4. BHI 选择培养基 Gm ／ Rif 选择培养基①： Gm500 μ g ／ ml ， Rif50 μ g ／ ml ； Gm ／ Rif 选择培养基②： Gm500 μ g ／ ml ， Rif32 μ g ／ ml ； Gm ／ Tet 选择培养基： Gm500 μ g ／ ml ， Tet64 μ g ／ ml ； Van ／ Rif 选择培养基①： Van64 μ g ／ m1 ， Rif50 μ g ／ ml ； Van ／ Rif 选择培养基②： Van64 μ g ／ ml ， Rif32 μ g ／ m1 ； Van ／ Tet 选择培养基 ： Van64 μ g ／ ml ， Tet64 μ g ／ ml 。

5. PCR 相关试剂购自赛百盛公司、天为时代公司。 PCR 仪为美国 Biotronic 公司 AG-9600 型扩增仪。

6 ． Vitek — AMs 全自动微生物系统 (bioMerieux Vitek ， Inc ． ) 。

二、方法

1 ．菌株鉴定及药敏试验全部试验菌株经 Vitek 全自动微生物系统鉴定，药敏试验按照 NCCLS 推荐 Kirby-Bauer 法进行，采用 2002 年 NCCLS 推荐琼脂稀释法，进行高耐庆大霉素 (MIC>500 μ g ／ m1) 、高耐链霉素 (MIC>2000 μ g ／ m1) 、耐万古霉素 (MIC>6 μ g ／ m1) 的确证，以及利福平的 MIC 测定。

2 ．质粒接合转移试验

(1) 肉汤接合法 按参考文献 [2] ，进行，将活化后的保存菌株用生理盐水调制浊度为麦氏管 0.5 号，取 5 μ l 菌液于 1m 1 中不同的液体培养基：普通肉汤 (NB) 、普通肉汤加马血清 (NBH) 、心脑浸液 (BHl) 、 BHI 加马血清 (NBH) 。 35 ℃ 培养 4h ，取供体菌及受体菌各 20 μ l 、 60 μ l 按 1 ： 3 混合，加入到 2ml 相对应的液体培养基中， 35 ℃ 振荡培养 4h ，离心后取少量沉淀培养物转种于含抗菌药物的 BHI 选择培养基， 48h 观察结果，有菌落生长者即为接合转移成功。

(2) 滤膜接合法 按参考文献 [3] 进行，将活化后的保存菌株用生理盐水调制浊度为麦氏管 0.5 号，取 5 μ l 菌液于 lml 中液体培养基 35 ℃ 培养 4h ，取供体菌及受体菌各 20 μ l 、 60 μ l 按 1 ： 3 混合，直接涂布于灭菌的无菌滤膜 ( 孔径 0.22 μ m) ，将滤膜置于 BHI 平板中， 35 ℃ 培养过夜，用 1mlBHI 肉汤冲洗滤膜，将冲洗液转种于 BHI 选择培养基， 48h 观察结果，有菌落生长者即为接合转移成功。

3 ．质粒 DNA 的提取：采用碱性裂解法 [4] ，裂解液 I 中不必加入溶菌酶，加入Ⅱ液后静置时间延长至 7 ～ 10min 。

4. PCR 法检测耐药基因 检测双功能酶基因 aac( 6' )-apb( 2 ” ) 的引物 [5] 为 5' -TGA TGA TTT TCC TTT GAT GT — 3' 和 5' — CAA TCT TTA TAA GTC CTT TT -3' 。 20 μ l PCR 反应体系，扩增条件：预变性 94 ℃ 5min ，变性 94 ℃ 30s ，退火 52 ℃ 30s ，延伸 72 ℃ 60s ， 30 个循环，分别以 ATCC51299 和 ATCC29212 作为阳性和阴性对照。

结 果

1 ．粪肠球菌标准菌株 ATCC51299 、 ATCC29212 质控结果见表 1 。

表 1 粪肠球菌标准菌株在 8 种抗生素培养基上的生长结果

注：“ + ”有菌落生长，“—”无生长。

2 ．质粒接合转移试验结果

(1)36 株粪场球菌耐药质粒液体接合转移和滤膜接合转移试验的结果见表 2 。

表 2 36 株粪肠球菌质粒接合转移结果

注：普通肉汤（ NB ）、普通内汤加马血清（ NBH ）、心脑浸液（ BHI ）、 BHI 加马血清（ BHIH ）

(2) 使用 BHI 肉汤作为培养反应介质， 15 株 HLCR 屎肠球菌中无一株将 HLGR 耐药性转移至 JH2 — 2 。但通过滤膜接合法，有 14 株转移成功。

(3) 使用 BHI 培养反应介质， VRE 肠球菌将对万古霉素耐药性转移至 JH2 — 2 。

(4) 肉汤接合法、滤膜接合法均未能将 HLGR 、 VRE 的耐药性从肠球菌属转移至金黄色葡萄球菌 S1106 、表皮葡萄球菌 S368 。

3 ． HLGR 粪肠球菌的供体菌与结合子药敏试验结果见表 3 ，表 4 。 36 株粪肠球菌均对 3 种以上抗菌药耐药， 36 ％ (13 ／ 36) 和 47 ％ (17 ／ 36) 的菌株对 4 种和 5 种以上抗菌药耐药。

表 3 HLGR 供体菌株及结合子的药敏试验结果

4 ． PCR 耐药基因检测 在 36 株粪肠球菌及 14 株屎肠球菌供体菌及所形成的结合子中均检测到了 aac( 6' )-aph( 2 ” ) 基因。

表 4 36 株粪肠球菌及结合子耐药谱

注：“ R ”耐药

讨 论

　　本次试验中分离到的 36 株 HLGR 粪肠球菌，全部多重耐药。对红霉素的耐药率最高 (97 ％ ) ，四环素次之 (81 ％ ) ，链霉素和氯霉素分别为 58 ％和 56 ％，氨苄西林与青霉素的耐药率相对较低。实验所选的 7 种抗菌药物中，所有菌株对三种或三种以上抗生素耐药， 47 ％的菌株对五种及五种以上抗菌药物耐药。 100 ％的粪肠球菌将 HLGR 的耐药性转移到了受体菌 JH2-2 ，并伴有其他耐药性的同时转移，大多数抗菌药的耐药性都可通过接合方式转移到受体菌，氨苄西林与青霉素的耐药性转移也远低于其他抗菌药。但伴随四环素、红霉素、链霉索耐药性转移的比例较大，而针对青霉素、氨苄西林的耐药性同时转移的比例较小。可见，庆大霉素、链霉素、红霉素、四环素的耐药基因位于同一个接合型转移单位的机率大于青霉素、氨苄西林的耐药基因。

　　通过试验证明接合转移是肠球菌耐药性转移的重要方式，接合转移试验是研究肠球菌耐药性转移的重要方法。

　　根据文献报道 [6] 信息素应答质粒可在肉汤 ( 液体 ) 中有效转移，其主要存在于粪肠球菌中。通过普通肉汤、普通肉汤加马血清、 BHI 、 BHI 加马血清四种培养基作为接合反应前、接合反应中的培养基的比较，发现普通肉汤作为培养基时转移通过率 (50 ％ ) 最低．而普通肉汤加马血清、 BHI 或 BHI 加马血清作为培养基时转移通过率相对提高，分别为 75 ％、 89 ％。实验结果证明，按合效率随营养条件的改善而提高，但在营养较充足时，转移效率便不再受之影响。在接合反应过程中使反应体系保持适当的振动，可以使肠球菌分散均匀，增加潜在供体菌与受体菌的接触机会，提高结合效率。接合反应结束时，适当离心，取沉淀反应物转入选择培养基，以防止转移频率过低时，所取菌液中不含结合子。

　　在供体菌与形成的结合子中均检测到了 aac( 6 ' ) — aph( 2 ” ) 基因，证明接合转移试验方法可靠。

　　对于非信息素应答质粒、接合性转座子的接合反应，在液体中很难转移，一般需在固体表面进行，如滤膜接合法。 15 株屎肠球菌肉汤接合试验虽然没有成功，但滤膜接合试验却有 14 株转移成功。同时， 4 株粪肠球菌在肉汤中未转移的质粒也都通过滤膜接合法转移成功。滤膜为接合反应的细菌提供了稳定、持久的接触表面，促进了接合反应的进行。

　　无论是通过肉汤接合法，还是滤膜接合法， HLGR 及 VER 的耐药性都未能从肠球菌转移至表皮葡萄球菌 S386 和金黄色葡萄球菌 S1106 ，有可能转移较困难，仍需做进一步的试验进行观察。但近年的研究表明，肠球菌中的多种耐药性来自于葡萄球菌属。

参考文献

1. N.Kobayashi,Md.Mahbub Alam,Y.Nishimoto,et al.Distribution of aminoglycoside resistance genes in recent clinical isolates of enterococcus faecalis,Enteroccus faecium and Enterocccus avium.Epidemiol.infect.2001,126 ： 197-204

2. Dunny, G.M.R.A.Craig,R.L.Carron,and D.B.Clewell. Plasmid transfer in Streptococcus faecalis ： production of multiple sex pheromones by recipients.Plasmid.1979,2 ： 454-465.

3. Werner G,Willems RJ,Hildebrandt B,et al, Influence of transferable genetic determinants on the outcome of typing methods commonly used for Enterococcus faecium.Journal of Clinical Microbiology.2003,41 ： 1369-1506.

4. 卢圣栋主编 . 现代分子生物学实验技术 . 第二版 . 中国协和医科大学出版社， 1999 ； 109-115.

5 ． Swenson JM,Ferraro MJ,Sahm DF,et al. Multilaboratory evaluation of screening methods for detection of high-level aminoglycoside resistance in enterococci. National Committee for Clinical Laboratory Standards Study Group on Enterococci.J Clin Microbiol. 1995,33 ： 3008-18.

6. Wirth R.Sex pheromones and gene transfer in Enterococcus faecalis.Res Microbiol.2000 ， 151 ： 493-6.

摘自《临床检验及实验室设备》 2005 年 6 月第七卷第 2 期