凝血实验室检查标准化及质量控制
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血栓与止血的实验室检查的临床重要性与日俱增，检验内容不断扩大，工作量也日益增多；不断出现的方法革新和自动化，改变了以往单靠手工操作，自配试剂，工作效率低的局面。与些同时，要求方法标准化和实行质量控制的呼声也愈来愈高。然而由于血液学检查，特别是血栓与止血检测的特殊性，迄今为止，除了凝血检验中的凝血酶原时间和活化的部分凝血活酶时间以及最近几年对血浆纤维白原的测定有了标准化的试剂（如PT）、标准品（如纤维蛋白原）、质控品或统一的表达结果的报告方式等以外，其他方面，如血小板的功能测定、抗凝因子及纤溶相关因子的测定等尚未有成熟的方案。
本文仅就上述已较成熟，并经ICSH、ICTH或美国的国家临床化验室标准委员会（NCCLS）等以文件公布的PT、APTT和纤维蛋白原三项的标准化及质量控制作一介绍。不过，PT（一期法）和APTT是用功能测定（而非免疫学和化学测定）凝血因子的基础，诸多凝血及部分抗凝因子的检测是通过PT或APTT的基本方法来实现的。所以有了这一基础，也便于实现上述各因子测定的标准化和质量控制。
凝血酶原时间（PT）
自从1935年 Quick 建立了PT测定方法以来，历经60余年，经久不衰，至今它仍然是检查所谓“外源”凝血途径诸因子及相关抑制物的重要过筛试验，并且是监控口服抗凝药治疗的主要手段。
PT测定受很多因素影响，诸如标本的采集方法及器材，贮血容器的性质，抗凝剂的种类和用量，标本的运送和贮存条件，孵育温度及时间，凝血活酶试剂的种类和质量（敏感性）以及判读终点的方法等，均会影响测定结果。此外，报告结果的方式也必须统一，特别是用于监控口服抗凝药物治疗时。所有这一切，都必须使方法标准化和建立有效的质量控制。
早在1973年，在维也纳召开的第四届血栓与止血国际会议上，由ICSH 和ICTH联合成立了口服抗凝药控制专家组（Expert Panel on Oral Anticoagulant Control），要求该组制订推荐一个PT测定标准化方案。经过多个实验室的协作研究，在1975年该专家组提出了第一个人血一期凝血酶原时间试验参考方法(reference method for the one-stage prothrombin time test on human blood)并于1976年发表（编号ICSH-EP14/1：1975）。[2]该文件重点是讲标本采集和PT的测定方法，对于报告结果和质量控制只简单地提了几句。而至关重要的PT试剂--凝血活酶的标准化问题，当时虽已注意到，但因条件尚未成熟，仅答应进一步研究完成后再修订。众所周知，不同的凝血活酶，检测相关的凝血因子缺乏的敏感性是不同的。因此要使PT标准化，使不同的实验室虽用了不同的凝血活酶，也能得到同样的（可比的）结果。
此后，经过几个著名实验室历时数年的共同努力，并用世界卫生组织（WHO）参与，以当时已在英国作为统一标准使用的“英国比较凝血活酶”(british comparative thromboplastin,简称BCT)为基础，制备了WHO的原级凝血活酶参考品(primary reference preparaation)人脑制品，编号67/40；同时制备了牛脑（68/34）和免脑（70/178）两个月67/40标化的次参考品(secondary reference preparation)。[3~4]后来，WHO又发表了其他一些次级参考品，迄今已在世界各国广泛用于校正本地制备或工在生产的PT参考物。[5]
与此同时，在口服抗凝药物治疗中，用PT监控时的报告方式也列入了议事日程。如上所述，各种凝血活酶对凝血因子有不同敏感性。为了使不同敏感性的试剂得到同样的测定结果，首先要制定一个共同的敏感性指标。这就要通过用自制的试剂与IRP进行比较后，得到一个校正值。具体的做法是：用多份口服抗凝药后不同程度地缺乏凝血因子的病人血浆和正常对照（至少混合10个正常人）的血浆，同时用自制凝血活酶和国际参考品（IRP）测定PT（结果用秒表示），分别计算出各自与正常对照血浆的比率。然后在双对数纸上作图，以IRP的比率为纵坐标，自制凝血活酶的比率为横坐标，通过回归分析，其回归线的斜率称为国际敏感指数，简称ISI。此数值愈低PT试剂愈低敏感（人脑制的原级标准作为1.0） 。
从理论上讲，不管何种凝血活酶，只要标上ISI，就可以与国际参考制品进行对比校正，并可用同一种计量单位报告。1985年，ICSH和ICTH发表了在口服抗凝药监控中推荐的PT报告方式（即ICSH/ICTH recommendations for reporting protrombin time in oral anticoagulant control）。该文件提出用国际标准化比率（international normalized ratil简称INR）来报告PT试验结果，[6]INR的计算公式如下：
INR=PTR[S]
式中PTR表示患者的PT与正常对照PT的比值；ISI为国际敏感指数。
方件要求试剂厂家每批凝血活酶试剂都必须标明ISI值，以便使用者计算INR。目前各国在口服华法令类抗凝药物时，已广泛使用INR作为控制用药量的指标，ICSH和ICTH已声明，今后凡有关此种监控的论文，如不用INR表达PT结果，医学科学刊物将不了予接受。
在用INR以后，各种敏感性不同的凝血活酶均可得到相同INR值，这对于用手工法（倾斜试管法）定PT值并用手工法测定PT来讲是正确的。但后来发现，手工与仪器法以及仪器与仪器之间，INR仍有差别。为此Chantarangkui等提出建议，同一凝血活酶试剂用于不同的仪器时，可用所谓“仪器特有的ISI”（instrumrnt specific ISIs）来计算INR。WHO在发放IRP时，亦可附上这种仪器特有的ISI。[7]
除了ICSH、ICTH和WHO发布的有关PT测定标准化的文件以外，1992年美国的NCCLS也发表了编号为H28-T的有关PT测定标准化的文件。[8]本文以下将综合上述文件，提出我国PT测定标准化和质量控制的方案，供讨论。
一、原理
将凝血活酶（主要含组织因子和脂质）和钙离子，加到枸橼酸抗凝血浆中，在37℃保温,测定血浆凝固时间,即为PT.本法主要用于过筛检测外源凝血途径的第VII、II、V、X因子和相关因子的抑制物。
二、试剂
1、抗凝剂：109mmo1/L枸橼酸钠液（相当于含二分子结晶水的橼酸钠32g/L）
2、凝血活酶试剂：市售商品，应标有ISI、批号及有效期。冻干者应按说明书加指定的缓冲稀释剂复溶。
3、氯化钙（CaCl2）溶液，浓度为25mmo1/L。
（目前有些商品试剂已将凝血活酶液与氯化钙液混合好，可不必另配CaCl2液）
4、质控物，正常及异常对照血浆。
三、仪器
1、手工法：秒表，保持37℃±1℃的恒温水浴箱或电热块。
2、仪器法：各种自动或半自动凝血仪，严格按说明书操作。
四、血液样品的采集、运送及贮存
1、用一次性塑料采血器或硅化玻璃注射器。采血时止血带不可束缚过紧，并不应超过5分钟。（针管内见到血即应解开止血带）否则某些凝血及纤溶因子会活化，并可能使Hct长高。
2、血与枸橼酸钠抗凝剂按9:1混合，轻轻颠倒混匀。可用特制的已加有定量枸橼酸钠液的抽空硅化管（国内已大量生产）采血，可保证血与枸橼酸钠比例准确，防止凝血因子活化，并保持清洁，防止试管和不合格橡皮塞的污染。
血液如发现凝固即应弃去不用，也不可污染组织液。
3、贮血应用塑料管或硅化试管（国内已有商品大量供应）或其他不沾湿的容器，避免接触活化凝血因子。取得血液后应尽快送到血液检验室。在运送中应避免剧列振动和日光直射。一般要求自采血到测定在2小时内完成，不可久贮。如在室温中贮存过久，第V因子等会破坏；另一方面，冷冻或在4℃贮存过久,会导致第VII因子活化,使PT缩短，有报道有些口服抗凝药的患者，全血在4℃贮存2-4小时,其PT可接近正常.故实验室在取得血样后尽快离心,分离血浆并尽快测定。
4、标本制备
PT和APTT都应用乏血小板血浆（PPP），分离血浆时要求相对离心力2000-2500×g,离心30分钟,用浊度法测定终点的自动化凝血仪,溶血和较明显的黄疸及脂血均会影响测定结果,此时可用手工法或电子机械式凝血仪测定.
五、测定步骤
1、手工法
⑴测定温度36.5-38.5℃，上述各试剂及被测血浆，均应预温至此一温度，但凝血活酶试剂预温不可超过30分钟，血浆预温一般不宜超过10分钟。
⑵所用试管及加样器等接触血浆的器具均应为塑料或硅化玻璃管。
⑶吸取枸橼酸抗凝了血浆0.1ml,加入一小试管中；加入凝血活酶 试剂0.1.ml混匀后置37℃水浴中。再加入25mmo1/L CaCl2 液0.1ml,(也可先将凝血活酶试剂与CaCl2溶液等量混合,加入0.2ml)。立即混匀并不开动秒表；试管仍浸于水浴中；，至约10秒钟时，自水浴中取出，在纱布上迅速擦去试管外水滴，在明亮处不断倾斜试管，在流动状态下观察有无纤维蛋白形成。一旦见到纤维蛋白（同时将出现液体流动减慢），立即停表，记录时间。每次测定二管，按平均数报告。
本试验的最后混合液其中PH 应为7.2-7.3，大部分商品凝血活酶试剂均用含缓冲液的溶液配制。
⑷每批均应同时做正常和异常对照，方法应与测定标本完全相同。
2、仪器法
凝血测定仪大体上可分为光电浊度和电子机械法两大类，自动化程度也不一样。一般仪器均供应配套试剂，各有详细说明书，应严格按说明书操作。
六、报告
1、以PT的秒（S）数报告（最接近的0.5秒）。
2、以患血浆PT（S）/正常对照PT(S)的比率（PRT）报告。
3、在口服华法令类抗凝药物治疗监控时，应报告国际标准化比率，INR。大部分自动化化仪器可根据所测的PTR和凝血活酶试剂的ISI，自动算出INR。手工法可根据下列公式，有一计算器直接计算：
INR=PTRISI
INR=Antilog(ISI×logPTR)
用计算器计算时，先输入PTR值，继按lg键，再按×键后输入ISI值,接着按10X键(或按INV键后按10x键,或按第二功能键后再按lg键)即可得INR值。
Poller设计了一个简便的列线图，在取得PTR和ISI值后，即可从图上直接查出INR值，十分便利，国内已有介绍。[9，10]
ICSH规定，不再用稀释曲线或百分比（活动度）报告。[6]
七、参考值（范围）
因仪器/试剂不同，会得出不同结果，故很难统一规定参考值。各实验室应根据自己的仪器、试剂等条件，自行测定一批健康人，建立参考值。此后至少每年或当条件有变化时，根据新的条件，重新建立。PT测定的一切条件均应与患者血浆PT测定相同（包括采血、容器、抗凝剂等）。健康供血者应选至少20个18-55岁的男性和非妊娠、月经期女性，不可服药，在平静休息状态采血，以减少个体差异（有条件时，可测一批老年人和小儿，分开统计）。同时应分开几天采血和测定，以减少天间差异。测定结果经统计学处理，计算标准差；以两个标准差（2SD）或95%可信限作为参考范围。对于三个标准差是正常还是差异常，需结合具体情况进行评价。从统计学上讲，其中有些人是正常的。用以上标准，病人（PT异常）则很少会遗漏。
八、质量控制
1、室内控制：每天开始，（工作量大的单位每40个样本一批）都必需用正常和异常对照血浆进行核对。这种血浆有商品供应，自制时正常血浆与上述参考血浆制备法相同。异常血浆则采用口服华法令类抗凝药，导致一个或一个以上因子部分缺乏，PT比正常对照延长1.5-2倍的患者血液，完全按上述制备血浆相同的条件制备，冰冻或冻干保存。但应注意，有些冻干品复融后会有混浊，影响浊度法自动血凝仪的测定。如发现有出控现象（超过原标定的平均数+2SD），应逐一检查仪器、试剂和质控血浆有无问题并加以校正。否则不能发出报告。
目前尚PT的血浆标准品，上述对照（质控）血浆主要供各实验室自己核查、校对用。
2、可接受的变异性（acceptable variability）
对于同一批质控血浆，分析系统中的试剂、仪器、加（取）样装置以及定时器等总的天与天之间的变异系数（不精密度）CV不得超过5%。
3、重复实验的变异系数（coefficient of variation for replicate test）
同份标本测定两次（下称双份测定），其差值的大小，可用来评价分析系统的批内精密度。正常血浆及异常（比正常延长1-2倍）血浆的双份测定，其CV 不应超过5%。
4、双份测定重现性（reproducibility of duplicate）
双份测定之间的差值的大小，通常用来作为结果可接受性的标准。此点有助于核查系统不精密度和/或偶然的分析误差。虽然这种由操作构成的差值的大小会因所用分析系统不同而有所变化，一般用双份测定之间的两次测定平均差10%作为可接受的标准。
5、室内质评：各实验室必需积极参加由检验中心组织的室间质评活动，以便及时了解本单位PT测定的准确性。虽然因仪器和试剂不同，同一份质控血浆可得到不同的结果，但用手工法，同一试剂结果是一致的。此外，不同类型的仪器/试剂，如分开统计，也有一定可比性。故回报时，应将仪器型号和试剂厂牌及批号等附上，以供比较。
九、造成结果错误的各种原因
1、样器(Specimen)或标本（Sample）有关的问题
⑴血样收集管注入血液过多或不足。
⑵患者红细胞比积>0.55%时未校正枸橼酸盐液体积.
⑶用了不正确的抗凝剂(如EDTA或草酸盐)或未加抗凝剂,或浓度不准确.
⑷用了已凝固、溶血、黄疸或脂血样品
⑸血样混匀不当或太剧烈的混匀。
⑹采血品或贮血管不洁，已受到污染。
⑺污染了肝素。
2、分析前的错误
血样送验延误或用了不合规定的方法运送、处理或贮存血样。
3、与试剂有关的问题
⑴试剂已被污染
⑵复溶时稀释剂加量不准确.
⑶复溶时未用推荐的试剂。
⑷试剂在运输、贮存过程中，由于处理不当而变质。
⑸试剂复溶后超过了规定的稳定期或试剂已超过有效期。
4、分析过程的错误
如孵育时间不准确：温度、加试剂量以及仪器操作布骤不准确等。
最后是安全性问题：由于接触血液有可能导致HIV、HBV或HCV的感染。国外对实验室工作人员的安全防护极为重视，在其操作规程中都将安全防护列为重要项目，PT和APTT的测定也不例外。在采集、运送及处理血样时，随时都要防止血样污染人体。操作中尽可能要戴手套。用一次性采、贮血样器具，用完后按规定消毒处理等。
活化的部分凝血活酶时间（APTT）
APTT是检测内源途径凝血因子缺陷和相关抑制物（包括狼疮抗凝因子）的试验，也是当前用于凝血因子治疗及肝素抗凝治疗监控的主要手段；其临床应用频率仅次于PT或与之相当。
APTT是从复钙时间和部分凝血活酶时间（PTT）改良而来。它用磷脂作为血小板代替物，加到去血小板血浆中，同时加入了活化第VII因子的激活剂。较之PTT，其凝固时间缩短，并且排除了血小板数量和功能对血浆凝固的影响。
和PT测定一样，不同的部分凝血活酶试剂对肝素和各种凝血因子缺陷的敏感性相差很大；不同的激活剂及激活时间对测定结果也很大影响。迄今为止，ICSH和ICTH尚未有APTT测定标准化或试剂标准化的方案，仅NCCLS于1992提出了一个编号为H29-T的暂行方案。[11]
1994年Reed等组织了13个实验室（中心）协作，试图将PT测定用的ISI和INR 体系用于标化APTT试剂，以便用肝素治疗的临控，结果大失所望。[13]他们用在体外加入不同量肝素的冻干血浆（体外肝素血浆）、新鲜血浆和接受肝素抗凝冶疗，血浆中含有肝素的血浆（体内肝素血浆），按PT标化凝血活酶试剂的方法进行测定，结果发现，各种部分凝血活酶试剂，其体外肝素血浆和体内肝素血浆的敏感性有很大差别。他们用了五个试剂，也用ISI来统一标化，结果不成功。因为无论用哪一个试剂作标准，实验室之间差别都很大。正常及病人血浆凝固时间的回归线往往不平行或偏斜。因此认为用这种方法标化部分凝血活酶不理想。而1995年Vander velde 和 poller由 ISTH/ICSH组织协作研究用APTT监测肝素的标准化，[13]所得结果有所不同（所有的方法基本相似），他们选用的三个试剂中，有两个几乎同样地好，其中一个被选作参考试剂。但他们也不主张用单一标上b值（校正常数，即病人和正常血浆回归线的斜率）的试剂，供所有实验室使用，而要各实验室自己标定自己的试剂。总之，APTT试剂和测定的标准化还远未成熟。以下就NCCLS推荐的方法，结合其它资料作一介绍，供国内APTT测定标准化参考。
一、原理
将一种磷脂和激活剂加到血浆中，经过孵育后，加入适当浓度的钙离子。其纤维蛋白凝块形成的时间（以秒计），即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径凝血因子和共同途径因子的缺陷，如因子XII、VIII、IX、PK、HMWK以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子的抑制物测定、肝素治疗的监测以及狼疮抗凝因子的检查。
二、仪器
本法所用仪器、设备（包括采血、贮血容器、加样装置等）以及对它们的要求完全与PT相同。PT 所用自动化仪器同样适于本法。
三、试剂
1、部分凝血活酶试剂（一种脑磷脂）由商品供应，一般已与激活剂按比例配在一起（或分开配制），常用的激活剂有硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagicacid）或其它可用的激活剂，由厂方配套供应。
APTT试剂仪器结合，应能使第VIII、IX或因子活性低于0.3/ml(或<30%)的血浆,出现异常延长的结果。
2、氯化钙溶液（25mmol/L）以及其它试剂与PT所用者相同。
四、测定步骤
1、样品的采取、贮存、运送与PT测定同。注意，应用清洁的塑料或硅化玻璃采血器采血及贮血。
2、标本（去血小板的血浆）的制备与PT同。注意，应用去血小板血浆测定。
3、水浴箱或电热块的温度为37±1℃，要经常检查是否准确。
4、接触活化时间：加激活剂活化XII因子的时间要保持一致。各仪器和试剂生产厂家的规定可能不一样，应严格按说明书要求进行。手工操作时，应用秒表或类似的定时装置计时。
5、操作
预温（不超过30分钟）APTT试剂一份与预温（不超过10分钟）的待测血浆一份混合，立即开动秒表计时。至规定的接触活化时间终点时，加入预温37℃的CaCl2液一份,混匀,同时开动秒表。至出现血浆凝固时，停表，计录血浆凝固时间（以秒计）。手工测定时应同时测定两管，按平均数报告。一些精密度已有很大改进的自动或半自动凝血仪，如果有适当的质控标准也可只测定一次。此外，应同时测定正常和异常对照血浆。
五、对肝素的敏感性
APTT常用于肝素治疗的监测，通常以患者APTT与正常血浆APTT的比率在1.5-2.5作为治疗控制范围。但不同的试剂/仪器系统对肝素的敏感性不同，其试剂/仪器系统对肝素的敏感性可进行测定。体外的敏感性（invitro sensitivity）是指将临床在使用的同类型的肝素按其治疗浓度，加到正常血浆中，测定APTT。体外敏感性与体内(invivo)敏感性不等同，但可作参考。
六、狼疮抗凝因子
狼疮抗凝因子是一种抗磷脂的自身抗体，由于它抗凝血的重要成分磷脂，故能干扰凝血。血中如存在狼疮抗凝因子，APTT将延长。但APTT试剂对狼疮抗凝因子敏感或不敏感有很大差别，试剂制造厂家应提供足够的说明，有关的国家机构也可提供对狼疮因子第三性差异的资料。但要知道，病人个体之间也有很大差异（杂合性），没有一种试剂能测出所有狼疮抗凝因子。
关于APTT参考值的建立、质控物制备、质控方法以及差错产生的原因等，与PT测定完全一样，请参阅PT测定有关部分。
附：凝血因子缺陷与循环存在抗凝物的简易鉴别方法，取病人及正常人新血浆，分别按下述体积混合：
血 浆 试 管
1 2 3 4 5
正常人ml 0.0 0.1 0.25 0.4 0.5
病 人ml 0.5 0.4 0.25 0.1 0.0
完全混匀后，在37℃水浴中保存，测定前再混匀。将各管混合血浆，分别测定APTT各两次。余下的混合血浆仍置37℃,一小时再重复测定,每管测两次.
结果解释：加入含50%正常血浆（即第3管），APTT仍延长者，可能存在抑制物。如加入20%病人血浆（第4管）使正常血浆APTT明显延长者，提示病人血浆可能存在抑制物。有些抑制物需在37℃孵育1小时后才表现抑制作用(如第VIII因子抑制物)，而狼疮抗凝因子则两者无差别。如加入正常血浆后，病人的APTT延长被纠正，则可能是由于凝血因子缺陷，而非抑制物所引起。
摘自《中华医疗器械工作站》
