【交流】胶体金免疫层析诊断试纸(lateral-flow)试验结果分析方法
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胶体金免疫层析诊断试纸(lateral-flow)试验结果分析方法
近日有许多朋友询问胶体金试纸如何记录和分析试验结果,每次试验面对的都是使用肉眼判断条带颜色深浅,不同的人对结果的判断都不相同,容易出现误判,平行试验结果无法对比.且试验结果无法直接记录,不能留下有说服力的试验结果证明,就这个问题,我将谈我的一些看法.以下讨论仅针对普通胶体金试纸,荧光,化学发光,磁粒子等特殊标记物必然需要读条仪器.
现状.
很多学术论文中对胶体金试验的结果记录通常是罗列简单的阴性(-)阳性(+)来表示.对于实验结果,很少有人提供T线吸收色度值,甚至图片来说明.严格的说,这些论文的真实性,可信性都很难让人信服. 同时,在做产品的时候,QC检测中如何去判断产品是否合格,简单的-,+也不能很好的说明产品质量. 有一些厂家也推出了商品化的胶体金结果读条仪,包括BIODOT的TSR3000读条仪,国产读条仪和其他自制的读条系统. 然而这些仪器又有多大作用,是否能真正快速的解决我们所遇到的问题呢?
原理.
要分析试纸实验结果,首先需要了解试验结果的获取过程.
在试纸条的T线位置,通常是由于免疫反应出现胶体金标记物的滞留,出现深红色条带. 我们所观察到的是可视信号. 同一个条带的颜色在不同的位置可能有深有浅,还会有中空,泛白,鬼线等干扰现象. 同时由于NC膜,标记物释放,点样过程等等问题. 在NC膜表面残留了或多或少的金溶液残留信号,对我们需要的信号产生干扰.
测试不同浓度的样本,T线的颜色深浅度可能不同.且需要在做实验过程中进行比较.
不同的处理样品垫配方,处理T线溶液配方,胶体金溶液配方可能有不同的颜色深度. 且需要在做实验时候进行比较.
在做老化存放实验时,不同时间做的测试可能有不同的颜色深度,且需要在实验过程中进行比较.
判读结果的时间一般是滴加样品后3分钟或者5分钟.(以下用3分钟情况为举例说明.)
那么从以上分析可知我们的需求. 在滴加样品后,3分钟,需要读取可见信号,并要对付一定的干扰. 同时要将这个信号转化为可比较的数字信号.
实践
1.色卡法
如何实现用肉眼快速判别,又有一定标准,那么色卡法将是一个很好的选择. 该方法投入资金量非常小,且能够建立一个简易的判别标准.实际操作情况如下.
所需资源, 标准颜色比较卡一本(印刷行业使用,廉价,仅用于颜色选定可以考虑借用),彩色打印机(为保证色彩还原性好,可以考虑到附近的照片打印店制作),相片打印纸若干.已经反应过的胶体金试纸条,需要强阳性,弱阳性和阴性.
制作步骤,
1)选色,将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡比较,选出合适的颜色,注意不同的反应浓度颜色梯度使用的标准色不同,梯度越多则做出来的色卡越准确, 一般是设置出0-9档, 0为全阴性,9为强阳性,中间梯度递增.
2)将选出的颜色打印到选好的相片纸上,相片纸的背景色最好和膜的颜色保持一致,不要过白.打印的图形应该和胶体金试纸的点样线条一致.即从左到右,上C下T,4mm/每段线条,线条间隔>4mm,共10组(0-9档). 打印后一定要做覆膜否则颜色非常容易掉.
3)在每档的上方都标明档次,方便比对读数.
4)如果要求比较高,可以以该打印色卡装配到成型的胶体金试纸条内,仿真程度则极高.
使用步骤,
将反应好的试纸条T线颜色与制作的色卡比较,看颜色属于那一个档次,则在数据记录时候填写该档次标识.最后做灵敏度比较.
该方法的优点在于使用方便,为肉眼判别设定了比较标准,能转化为档次数据.缺点在于人眼对颜色的敏感性差异较大,同一个试纸T线不同的人可能会归类到不一样的档次标准上.数据还是人眼判读,不适合做为数据证据.于是出现了更好的图形扫描法.
2.图形扫描法
该方法使用的资源非常容易解决,普通的扫描仪器就能够胜任.且能对最后结果做精确的数据分析.
需要的资源,普通扫描仪,能扫描灰度图象即可.能对灰度线条图象进行读数的软件,试纸条的反应线条和薄层层析的线条实际上是很相似的,所以软件也可以借用那个领域成熟的产品,有很多例如bandscan,都是免费的.
使用步骤,
将反应好的试纸条放在扫描仪器内,选择灰度扫描,获得灰度线条图象.
然后打开分析软件,将该灰度图象导入,自动分析出峰条带(=可以看出是否有前后带效应),峰面积(=灵敏度),本底情况(=跑板是否干净),根据峰面积数值做平行线性分析,就能知道实验的重复性和获得回归曲线.
该方法的优点在于可以把反应信号数据化,并可以作为实验证据做发表.缺点是操作复杂一些,同时软件方面现在只能用很多其他领域用的版本,没有专门针对胶体金试纸版本,不是很方便. 如果有哪位懂编程知识,我可以与你合作开发这个方面的共享软件,已方便大家使用.
3.读条仪法
很多厂家都开发了对应的读条仪,大部分都是采用简单的30万象素数码摄像头做一个拍摄,然后用软件分析.做得好的如进口的使用的是cool ccd,干扰少一些,效果好一些,当然价格也贵,意义不大.做得差的如国产的读条仪用电脑城卖的普通民用数码摄像头,80块一个的成本,对外销售价格惊人,且还不如用扫描仪来得效果好.
以上是通用读条仪,也有生产厂家为自己的试纸产品专门定做的读条仪,那是针对其特定产品使用的,一般不兼容其他试纸,所以不做讨论.
结语
不好意思,这段时间工作生活都非常忙,一段文字花了两个月才结束.
希望我对这个问题的一些思路对你的技术工作提供帮助.同时也希望分享一些你的技巧经验.欢迎深入讨论.
Tom Bacon
Jul 20,2007 shanghai
近日有许多朋友询问胶体金试纸如何记录和分析试验结果,每次试验面对的都是使用肉眼判断条带颜色深浅,不同的人对结果的判断都不相同,容易出现误判,平行试验结果无法对比.且试验结果无法直接记录,不能留下有说服力的试验结果证明,就这个问题,我将谈我的一些看法.以下讨论仅针对普通胶体金试纸,荧光,化学发光,磁粒子等特殊标记物必然需要读条仪器.
现状.
很多学术论文中对胶体金试验的结果记录通常是罗列简单的阴性(-)阳性(+)来表示.对于实验结果,很少有人提供T线吸收色度值,甚至图片来说明.严格的说,这些论文的真实性,可信性都很难让人信服. 同时,在做产品的时候,QC检测中如何去判断产品是否合格,简单的-,+也不能很好的说明产品质量. 有一些厂家也推出了商品化的胶体金结果读条仪,包括BIODOT的TSR3000读条仪,国产读条仪和其他自制的读条系统. 然而这些仪器又有多大作用,是否能真正快速的解决我们所遇到的问题呢?
原理.
要分析试纸实验结果,首先需要了解试验结果的获取过程.
在试纸条的T线位置,通常是由于免疫反应出现胶体金标记物的滞留,出现深红色条带. 我们所观察到的是可视信号. 同一个条带的颜色在不同的位置可能有深有浅,还会有中空,泛白,鬼线等干扰现象. 同时由于NC膜,标记物释放,点样过程等等问题. 在NC膜表面残留了或多或少的金溶液残留信号,对我们需要的信号产生干扰.
测试不同浓度的样本,T线的颜色深浅度可能不同.且需要在做实验过程中进行比较.
不同的处理样品垫配方,处理T线溶液配方,胶体金溶液配方可能有不同的颜色深度. 且需要在做实验时候进行比较.
在做老化存放实验时,不同时间做的测试可能有不同的颜色深度,且需要在实验过程中进行比较.
判读结果的时间一般是滴加样品后3分钟或者5分钟.(以下用3分钟情况为举例说明.)
那么从以上分析可知我们的需求. 在滴加样品后,3分钟,需要读取可见信号,并要对付一定的干扰. 同时要将这个信号转化为可比较的数字信号.
实践
1.色卡法
如何实现用肉眼快速判别,又有一定标准,那么色卡法将是一个很好的选择. 该方法投入资金量非常小,且能够建立一个简易的判别标准.实际操作情况如下.
所需资源, 标准颜色比较卡一本(印刷行业使用,廉价,仅用于颜色选定可以考虑借用),彩色打印机(为保证色彩还原性好,可以考虑到附近的照片打印店制作),相片打印纸若干.已经反应过的胶体金试纸条,需要强阳性,弱阳性和阴性.
制作步骤,
1)选色,将胶体金试纸反应显色的T线条带颜色与标准色卡比较,选出合适的颜色,注意不同的反应浓度颜色梯度使用的标准色不同,梯度越多则做出来的色卡越准确, 一般是设置出0-9档, 0为全阴性,9为强阳性,中间梯度递增.
2)将选出的颜色打印到选好的相片纸上,相片纸的背景色最好和膜的颜色保持一致,不要过白.打印的图形应该和胶体金试纸的点样线条一致.即从左到右,上C下T,4mm/每段线条,线条间隔>4mm,共10组(0-9档). 打印后一定要做覆膜否则颜色非常容易掉.
3)在每档的上方都标明档次,方便比对读数.
4)如果要求比较高,可以以该打印色卡装配到成型的胶体金试纸条内,仿真程度则极高.
使用步骤,
将反应好的试纸条T线颜色与制作的色卡比较,看颜色属于那一个档次,则在数据记录时候填写该档次标识.最后做灵敏度比较.
该方法的优点在于使用方便,为肉眼判别设定了比较标准,能转化为档次数据.缺点在于人眼对颜色的敏感性差异较大,同一个试纸T线不同的人可能会归类到不一样的档次标准上.数据还是人眼判读,不适合做为数据证据.于是出现了更好的图形扫描法.
2.图形扫描法
该方法使用的资源非常容易解决,普通的扫描仪器就能够胜任.且能对最后结果做精确的数据分析.
需要的资源,普通扫描仪,能扫描灰度图象即可.能对灰度线条图象进行读数的软件,试纸条的反应线条和薄层层析的线条实际上是很相似的,所以软件也可以借用那个领域成熟的产品,有很多例如bandscan,都是免费的.
使用步骤,
将反应好的试纸条放在扫描仪器内,选择灰度扫描,获得灰度线条图象.
然后打开分析软件,将该灰度图象导入,自动分析出峰条带(=可以看出是否有前后带效应),峰面积(=灵敏度),本底情况(=跑板是否干净),根据峰面积数值做平行线性分析,就能知道实验的重复性和获得回归曲线.
该方法的优点在于可以把反应信号数据化,并可以作为实验证据做发表.缺点是操作复杂一些,同时软件方面现在只能用很多其他领域用的版本,没有专门针对胶体金试纸版本,不是很方便. 如果有哪位懂编程知识,我可以与你合作开发这个方面的共享软件,已方便大家使用.
3.读条仪法
很多厂家都开发了对应的读条仪,大部分都是采用简单的30万象素数码摄像头做一个拍摄,然后用软件分析.做得好的如进口的使用的是cool ccd,干扰少一些,效果好一些,当然价格也贵,意义不大.做得差的如国产的读条仪用电脑城卖的普通民用数码摄像头,80块一个的成本,对外销售价格惊人,且还不如用扫描仪来得效果好.
以上是通用读条仪,也有生产厂家为自己的试纸产品专门定做的读条仪,那是针对其特定产品使用的,一般不兼容其他试纸,所以不做讨论.
结语
不好意思,这段时间工作生活都非常忙,一段文字花了两个月才结束.
希望我对这个问题的一些思路对你的技术工作提供帮助.同时也希望分享一些你的技巧经验.欢迎深入讨论.
Tom Bacon
Jul 20,2007 shanghai
