幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制

一、方法

1、H.pylori配体固相硝酸纤维素膜的制备

H.pylor抗原室温融化后，12000r/min离心10min，取上清2mg/ml用0.01mol/L的PB缓冲液（pH 7.2）以250μg/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测带（T），距离检测带5mm远的质控带（C）用dispenser线形包被正常兔IgG(2mg/ml)。37℃干燥2h，4℃密封保存。

2、样品垫的处理

选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用。

3、试纸条组装

根据功能不同可将试纸条分为四个部分：上段（A区）为手持部位（吸水滤纸：吸收检测样品中多余液体），中段（B区）为实验反应区（硝酸纤维素膜：包括判读结果的检测带T和指示试纸条质量的质控带C），下段（D区）为样品区（玻璃纤维素膜：接触待检测样品），在中下段之间（C区）放置浸有胶体金标记SPA复合物的金标垫；而整个试纸条贴附于双面胶白色塑料背板。

4、临床血清标本H.pylor抗体IgG检测

取1998年3月～2001年9月期间在我院消化门诊就诊，临床诊断为幽门螺杆菌胃炎患儿血清53份。加入80μl 于试纸条样品区，2～5min开始观察结果，20min观察终止。出现1条红色（对照）沉淀线，为血清学诊断阴性；出现2条红色（样品和对照）沉淀线，为血清学诊断阳性。同时采用华美生物工程公司ELISA试剂盒对血清标本进行对照检测。组间阳性率采用U检验。

二、实验结果

1、 胶体金颗粒制备

我们实验所用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色，用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸胶体金后在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均匀，圆形。测量100个胶体金颗粒直径，平均直径约20nm.

2、胶体金标记SPA的最低稳定浓度、最适稳定量及最适pH

加入不同浓度SPA的胶体金溶液在加入氯化钠后呈现不同颜色（由蓝色伴聚合物沉淀逐渐过渡到亮红色），使胶体金溶液红色不变而蛋白质含量最低的试管中加入5μg SPA，因此确定本次制备的20nm胶体金标记SPA的最低稳定量是每毫升胶体金溶液5μg SPA，最适稳定量为每毫升胶体金溶液6μg SPA.

胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点（PI）略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，实验证实SPA标记的最适pH为6.0，符合预测。

3、 胶体金标记SPA复合物的制备与纯化

将胶体金溶液pH值调至6.0，30ml胶体金溶液在磁力搅拌下缓缓加入180μl SPA溶液（1mg/ml），加入PEG20000增加胶体金溶液的稳定性，超速离心纯化后在Tecnai10透射电镜下观察，可见金颗粒外围有明显的低密度晕圈，表明金颗粒表面吸附有蛋白。

4、临床血清标本H.pylor抗体IgG检测结果

53份受检血清中抗Hp血清抗体IgG胶体金法阳性21份，疑似7份，阴性25份；ELISA法阳性19份，疑似6份，阴性28份。组间阳性率比较差异无显著性（U检验，P＞0.05）。表3 两种检测临床血清标本H.pylor抗体IgG结果比较

三、讨论

胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。胶体金的制备并不难，但要制备高质量的胶体金却并非易事，通过反复实验我们出如下经验：

(1)所用化学试剂应为分析纯试剂，试剂质量直接胶体金制备的成功与否；

(2)配制溶液用水应为双蒸水或MQ超纯水，而且必须注意到不同来源的水其pH和离子强度有很大差异；

(3)玻璃器皿的清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。合格胶体金溶液应清亮透明，若混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备胶体金有较多凝集颗粒。

胶体金粒子大小不同，颜色亦不同［2］：5～20nm之间，呈葡萄酒红色；20～40nm之间液体为深红色；60nm金溶液呈紫红色，日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得金颗粒大小。不同大小的胶体金粒子具有不同的光散射作用，据此可用可见光光谱法评价胶体金的粒径及分布［3］。

鉴定胶体金最有说服力的是在透射电镜下观察，理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。拍片放大后测量金颗粒直径，符合制备要求。小颗粒胶体金基本是圆球形，30～80nm金颗粒则多为偏心圆形［2］。

如果金颗粒大小不等或有椭圆形、三角形金颗粒存在应重新制备，造成这种情况的主要原因一般与在加还原剂时没有迅速一次性加入以及搅拌不均匀有关；此外制备量的多少、容器的大小、加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。

制备好的胶体金可因电解质、温度、金溶液的浓度变化而有不稳定和聚沉。因此，制备后最好在20天以内进行标记，室温或4℃保存，避免低温冻存。实验中我们选择添加牛血清白蛋白作为稳定剂以维持胶体金的稳定性，使之便于长期保存，并防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。

牛血清白蛋白、PEG20000是最为常用的高分子稳定剂［4］。

胶体金颗粒与蛋白质的结合一般通过静电感应、蛋白质疏水作用吸附于金颗粒表面，或通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合［5］。

无论其作用机制为何，环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，一般只有在蛋白质等电点略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须用0.1mol/L碳酸钾溶液或0.1N 盐酸将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质等电点略偏碱。

由于胶体金会阻塞pH计电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，用精密的pH试纸测定其pH即可。

标记好的免疫胶体金纯化处理的目的是除去其中未标记的蛋白质、未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。根据胶体金颗粒大小不同和所标记蛋白质的特性不同，选择并调整离心转速和离心时间可以达到一般的纯化目的。

如有需要可将上述初步纯化免疫胶体金用10%～30%蔗糖或甘油溶液做密度梯度离心或用凝胶过滤法进一步纯化。

胶体金免疫层析试纸条的研制不仅在抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等方面至关重要，而且缓冲系统的优化尤其是各种辅助添加剂的选择，优化组合也必不可少。为确保试剂盒的稳定性，试纸条的组装须在洁净干燥的环境下进行，空气湿度＜20%为宜。

本试验制备的检测H.pylori IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条经临床血清标本检测，初步结果与国产ELISA试剂盒比较差异无显著性，说明两种方法在特异性、敏感性和稳定性有较好的一致性。

本旨在探索优化胶体金免疫层析诊断试纸条的研制技术，建立胶体金快速诊断层析试纸条研制的技术平台，从而为研究和开发系列胶体金免疫层析快速诊断试纸条提供有重要价值的实验依据和经验。

四、参考

1 陈敏章，胡伏莲，周殿元，等。幽门螺杆菌感染的基础与临床。北京：技术出版社，1997，322.

2 Bassab C，Syamal R.Manufacturing high-quality gold sol.IVD Technology，2001，8：46-54.

3 彭剑淳，刘晓达，丁晓萍，等。可见光光谱法评价胶体金粒径及分布。军事医学科学院院刊，2000，24（3）：75-77.

4 Hayat MA.Colloidal gold-principles，methods and applications.San Diego：Academic Press，1989，2-10.

5 Hermanson GT.Bioconjugate techniques.Academic Press，1996，593-602.