(交流)免疫细胞化学技术

一、免疫细胞化学技术的概述
•  免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)
–  是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。
(一) 对抗原和抗体的要求
•  具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
–  对抗体的要求：纯度高、比活性强；
•  高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
–  对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
(二) 抗原 (antigen, Ag)
•  抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：
–  免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；
–  免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
•  根据抗原是否显示免疫原性分为：
–  完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
•  免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
–  半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
•  半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载 体
•  通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
–  常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
–  用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体 (antibody, Ab)
1、抗体的概念：
•  机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
–  抗体主要存在于血清内；
–  抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
–  免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
•  单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
–  特异性强、抗体产量高。
•  多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
–  特异性低，会产生抗体的交叉反应。
–  多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
–  抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
•  动物的选择
•  佐剂(adjuvant)
•  免疫方法
•  免疫剂量
•  抗体效价的测定
•  放血或定期抽血
(1) 动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
•  所需抗血清的量
–  小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
•  能供免疫用的抗原量
–  小鼠50g足够，而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择(续)
•  动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
–  例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
–  常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。
(2) 佐剂 (adjuvant)
•  一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
•  最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:
–  弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)
–  弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)
弗氏不完全佐剂
(Freund's incomplete adjuvant, FIA)
•  是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
•  使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA)
•  在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。
•  免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。
–  一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
•  研磨法：适于制备大量的佐剂抗原
–  先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
–  按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
•  缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
•  注射器混合法
–  将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
•  优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
•  缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
•  快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
–  将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
–  每次乳化 10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。
•  优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
•  判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
(3) 免疫方法——免疫途径
•  常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
•  一般采用多点注射方法
–  常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
–  皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
(3) 免疫方法——免疫途径 (续)
•  几点说明：
–  大动物一般不用腹腔注射
–  颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
–  抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100g抗原即可获得较好的免疫效果。
–  皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
(3) 免疫方法——次数及间隔时间
•  次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)
–  首次注射后，10～15天再加强注射；
–  剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
•  间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长
–  豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；
–  第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫
•  初次免疫
–  用50～200g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；
•  两周后，加强免疫
–  将50～200g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；
•  抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血
–  抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
•  一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔
–  先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；
–  10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；
–  以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50g；
–  末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫
•  初次免疫
–  用10～100g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；
•  加强免疫
–  每隔 7～8天，将10～50g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；
•  抗体效价的检测
(4) 免疫剂量
•  抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；
•  免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
(4) 免疫剂量 (续)
•  各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
(5) 抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
•  指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
–  将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
•  优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
•  将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
•  将l ％ agar 融化后，置56C水浴。
•  在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。
•  中心孔加5l 抗原样品，周围孔内每孔加5l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。
•  凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
•  观察结果。
抗体效价检测的其它方法
•  环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；
•  对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；
•  酶联免疫吸附试验 (ELISA)。
(6) 放血或定期抽血
常用以下3种方法
•  颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
•  心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
•  静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。
(6) 放血或定期抽血 (续)
•  采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血
•  血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；
•  加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。
二、组织和细胞标本的制备
•  标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件
•  免疫组化对组织和细胞标本的要求
–  保持所检标本原有的结构、形态；
–  在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。
•  免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。
–  各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。
免疫组化中常用的组织和细胞标本
•  组织标本
–  石蜡切片
–  冰冻切片
•  细胞标本
–  组织印片
–  细胞培养片(细胞爬片)
–  细胞涂片
(一) 石蜡切片
•  石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法
–  最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；
–  石蜡块还能长期存档，供回顾研究。
•  石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
1、取材的特殊要求及注意事项
•  标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。
•  取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。
–  细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。
1、取材的特殊要求及注意事项(续)
•  避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；
–  镊取组织动作要轻；
–  经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。
2、固定及常用的固定液
•  取材后的组织需立刻投于固定剂中
–  固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；
–  对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
•  常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。
–  醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
–  醇类（常用乙醇）
–  其它 （丙酮）
(1) 醛类
•  甲醛(福尔马林)应用最广
–  原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。
–  优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。
–  缺点：
•  甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；
•  醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；
•  分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
–  注意事项：
•  缩短固定时间，降低固定温度(4C)，为此组织块不宜过厚。
•  改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。
•  固定后充分水洗以减少分子间交联。
•  切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

•  戊二醛：
–  穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
•  多聚甲醛(常用4%)：
–  可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。
•  主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(2) 醇类
•   最常用的醇类固定剂是乙醇。
–  其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
–  优点：穿透性强、抗原性保存好。
–  缺点：
•  脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。
•  乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
(3) 其它固定剂
•  丙酮：
–  对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修复——原因
•  常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：
–  抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；
–  蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
•  要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
3、抗原修复——方法
•  化学方法
•  加热方法
–  水浴加热法
–  微波照射法
–  高压加热法
–  酸水解法
(1) 化学方法
•  主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
–  胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37C，10～40min，主要用于细胞内抗原的显示；
–  胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37C、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。
•  例如：Laminin、CollagenIV
(2) 水浴加热法
•  将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
–  优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，
–  缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。

(3) 微波照射法
•  将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
•  此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。
(4) 高压加热法暴露抗原
•  将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。
•  由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。
(1) 酸水解法
•  酸水解可使交联断裂、暴露抗原。
•  将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。
•  此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。
加热法的注意事项
•  达到规定的温度(92～95C以上)；
•  维持一定的时间；
•  避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)；
•  加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；
•  修复液：
–  最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；
–  最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。
4、载玻片的处理
•  抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。
–  新载玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。
•  常用的粘附剂有：
–  APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）
–  Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）
–  铬明胶溶液
APES(3-aminopropyltriethoxysilane)
3-氨丙基三乙氧基硅烷
•  现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);
•  将洗净的玻片浸于此液中20～30秒钟；
•  取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60C烤箱烤干。
Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸)
•  将清洁玻片浸于100g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37C放置30min，然后60C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。
铬明胶溶液
•  试剂：铬明矾(chrome alum) 0.25g
明胶(gelatine) 2.5g
蒸馏水 500ml
•  先将铬明矾溶解于40C少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70 C水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。
•  用时稍加溶化，切片浸入2～3min，过夜晾干。
(二) 冰冻切片
•  冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。
•  在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。
–  缩短了制片时间
–  抗原性不受损失
•  对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。

•  组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。
1、冰冻组织块的常用方法
•  液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196C)中10～20sec；
•  干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至一70C ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；
–  上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。
–  制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 C冰箱。
2、切片
•  供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。
•  载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；
•  切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 C 。切片厚度一般为4～8m。
3、切片后处理
•  切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。
•  冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。
(三) 组织印片
•  将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。
(四) 细胞培养片(细胞爬片)
•  贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20C固定10～20min)，再进行免疫染色。
–  盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。
–  为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。
(五) 细胞涂片
•  大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：
–  血液、尿液、脑脊液；
–  体腔积液；
–  组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织
–  悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。
(五) 细胞涂片 (续)
•  细胞涂片的方法：
–  手涂法
•  将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。
•  图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。
–  涂片机涂片法
•  将细胞样品制成2×105～6/ml 细胞悬液，吸取50～100l (1～2×104～5cells) 加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。
三、免疫组化常用的染色方法
•  根据标记物的不同分为
–  (一) 免疫荧光法
–  (二) 免疫酶标法
–  (三) 亲和组织化学法
(一) 免疫荧光法
【原理】
•  用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；
•  荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；
•  借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
•  (1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)
•  (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)
•  (3) 四乙基罗丹明 (RB200)
•  (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)
(1) 异硫氰酸荧光素(FITC)
•  易溶于水和乙醇。
•  最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量 389.4。
•  在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。
(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
•  最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。
•  与蛋白质结合的方式同FITC。
(3) 四乙基罗丹明(RB200)
•  不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
•  最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。
•  RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸-氨基反应而标记在蛋白分子上。
(4) 碘化丙啶(PI)
•  是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。
•  PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。
•  最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
•  一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。
–  一般认为0～4C可保存1～2年，-20C可保存3～4年。
–  要小量分装，防止反复冻融。
–  保存前需加防腐剂 (浓度为1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000叠氮化钠) 。
3、免疫荧光的染色方法
•  免疫荧光染色法常用的有
–  直接法
–  间接法

原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。
直接免疫荧光法的操作步骤
•  标本的处理：
–  细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次；
–  石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；
•  2%BSA或10%BSA37C湿盒内封闭30min
•  抗体染色：
–  在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37C孵育30min；
直接免疫荧光法的操作步骤(续)
•  0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•  缓冲甘油封片
–  分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•  镜检：在荧光显微镜下观察。

•  优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•  缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。

直接免疫荧光法的注意事项
•  对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；
•  一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
直接免疫荧光法的注意事项 (续)
•  染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；
–  染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；
–  染色温度：多采用室温(25C)，高于37C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C的低温，延长染色时间。
–  低温染色过夜较37 C 30 min效果好的多。
直接免疫荧光法的注意事项 (续)
•  试验时需设置下列对照：
–  自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–  阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–  特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
•  若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
直接免疫荧光法的注意事项 (续)
•  一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；
•  经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
(2) 间接法又称为荧光抗-抗体法
 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
–  可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。
间接免疫荧光法操作步骤
•  标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；
•  一抗染色：
–  加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37C作用30min或4C过夜。
•  0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；
间接免疫荧光法操作步骤(续)
•   加荧光标记的二抗抗体，37C湿盒避光作用30min。
•  0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；
•  甘油缓冲液封片
•  镜检

•  优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；
•  缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。
间接免疫荧光法的注意事项
•  荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。
•  每次试验时 ，需设置以下三种对照：
–  阳性对照：阳性血清+荧光标记物
–  阴性对照：阴性血清+荧光标记物
–  荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
间接免疫荧光法的注意事项(续)
•  标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
•  一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。

(二) 免疫酶酶标法
【原理】
•  以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；
•  酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。
1、常用的标记酶及其显色底物
•  辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物
•  碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物
(1) 辣根过氧化物酶(HRP)及底物
•  HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好；
•  底物为过氧化物和供氢体(DH2)
–  过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。
–  供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化 型染料，最常用的供氢体是DAB。
DAB (二氨基联苯胺)
•  DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。
•  目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。
(2) 碱性磷酸酶(AP)及底物
•  AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：
–  偶氮偶联反应，底物为-萘酚磷酸盐，经水解后得-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fast red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。
–  靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。
2、常用的免疫酶染色方法
•  又分为以下两种方法：
–  酶标抗体法
•  直接法
•  间接法
–  非标记抗体酶法
•  酶桥法
•  PAP法
(1) 酶标抗体法
•  通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。
–  优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。
–  缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。
(1) 酶标抗体法——直接法
• 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。
(1) 酶标抗体法——间接法
•  将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。
酶标抗体间接法的操作步骤
•  标本准备：
–  石蜡脱蜡至水；
–  冰冻切片浸入4C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3；
–  细胞爬片先用PBS洗，然后4C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3；
•  石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；
(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续)
•  封闭内源性过氧化物酶：3％H2O2-甲醇溶液室温孵育5～10min (湿盒内) ；
•  0.01M PBST漂洗，5min×3；
•  5～10%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭，室温孵育30min (湿盒内) ；
•  倾去血清勿洗，加1％BSA(PBST配制)稀释的一抗， 37C孵育60min 或4C过夜(湿盒内)；
(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续)
•  0.01M PBST漂洗，5min×3；
•  加HRP标记的二抗室温孵育lh或37C 30min ；
•  加0.01％H2O2~0.05％DAB显色 (显色液应新鲜配置)；
•  经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。
(2) 非标记抗体酶法——酶桥法
•  首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；
•  以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；
•  再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布
–  优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。
几点说明
•  一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。
•  二抗——桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游离。
•  因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。

(2) 非标记抗体酶法——PAP法
•   与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替;
•  PAP是离体制备的复合物(HRP--抗HRP)。
•  显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。

PAP法评价
•  PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。
–  缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。
•  由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。
(三) 亲和组织化学法
•  是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。
•  这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。
生物素—抗生物素染色法
【原理】
•  生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。
•  抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。

•  两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。
–  该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。

(1)标记抗生物素—生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB)：分为直接法和间接法。
•  直接法

用生物素标记第一抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反应。
•   间接法

用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用第一抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与第一抗体相连结，最后进行呈色反应。
(2)桥抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method，BRAB)
–  此法是用生物素分别标记抗体和酶，以抗生物素为桥，把二者连接起来，进行呈色反应。
(3) 抗生物素-生物素-过氧化物酶法
(ABC法)
•  ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法。
•  ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的。
•  分为直接法和间接法。
–  直接法是生物素标记的一抗与ABC复合物结合；
–  间接法是生物素标记的二抗与ABC复合物结合。

ABC法的评价
•  敏感性强：ABC法比PAP法敏感性高20~40倍。
•  特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，一抗和二抗都可被稀释至可能的浓度，减少了非特异染色。
•  方法简便，节约时间。可由PAP法所需的2天缩短至几个小时。
•  由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫。