【共享】酶联免疫检测法应该注意的几个问题
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酶联免疫检测法应该注意的几个问题 转贴
近年来，疯牛病、瘦肉精事件的连续发生，人们震惊之余发现饲料在某种条件下不仅构成了对动物和人类健康的严重威胁，而且造成了意想不到的经济损失和巨大的政治影响。饲料安全作为食品安全中的一个源头环节，成了上至国际组织、政府部门，下至平民百姓，各个层面广泛关注的热点问题。世界上很多国家及非政府组织都积极加人了饲料、食品安全控制行列。各个国家与地区也都加大力度强化相关的组织机构，制定一系列的法律法规，如美国、日本修订了饲料安全法，欧盟成立了欧洲食品管理局，并将实行新的饲料食品管理法规，我国也颁布了《饲料和饲料添加剂管理条例》，实施了饲料安全工程。然而，再好的政策和措施都离不开饲料检测的技术支持，检测结果不仅是制定政策和标准如MRL的科学基础，也是采取重**律行动和解决贸易纠纷的重要依据。近年来，执行最有效、影响面最广的是饲料食品安全检测中有关违禁药品及兽药残留执法分析的逐级检测法。主要为筛选法、确证法和定量法。
筛选法是实施检测的第一步，用于大量样品的高通量分析。目的是检测某种或某类危害物是否存在。它简单快速不需要特殊的场地，不需要大型仪器设备，花费一般也较低。筛选法基于许多原理，但目前应用最多的是酶联免疫法(ELISA)。如饲料中违禁药品盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、安定、呋喃唑酮、己西雌酚的检测，尿液中盐酸克仑特罗、猪肝盐酸克仑特罗、牛奶中氯霉素的残留检测的各种试剂盒都属酶联免疫法(ELISA)。
自治区兽药饲料监察所从2000年就开始用酶联免疫法检测饲料中盐酸克仑特罗，到2004年开始大批量承担农业部及自治区下达的饲料安全检测项目，主要为饲料、饮水、尿液中盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、安定、呋喃唑酮、己西雌酚的检测。根据农业部要求首先用酶联免疫法进行筛选，检测出阳性者用高效液相色谱仪和气质联用仪进行确证和定量。本人就这几年应用酶联免疫法进行初筛检测中存在的问题及注意事项进行探讨，以供同行参考。
目前酶联免疫法检测用试剂盒种类繁多，有国外进口的，有国内自行研制生产的，如何在众多的品牌中选择既能满足检测要求又价格低廉的试剂盒是一个问题。本人根据使用这些试剂盒，在实际检测中发现，一般在试剂盒说明书中列出以下指标：最低检测限；回收率；交叉反应率；标准曲线图谱及数据，标准曲线至少由5个浓度组成；IC50测定值及变形曲线点数目的是比较规范的试剂盒，可以选择。
2 临界值(cut-off)的确定
在实际使用酶联免疫法检测时要首先确定临界值。通过检测结果与临界值的比较，可判定样品为阴性或可疑。对于禁用药物，检测方法的临界值为定量限，即现有的公认的仪器检测所能达到的最低定量限。对于有最高残留限量(MRL)的药物，检测方法的临界值为20份添加MRL浓度的样品重复3次测定的均值减去1．64倍标准差。检测结果如小于临界值为阴性，大于或等于临界值或标准规定为可疑，需要用确证法确证。
3 检测限的测定 可添加MRL和MRL上下各一个浓度。
每个试验室在使用酶联免疫法检测时，应做一下各自试验室的检测限。检测限为20份空白样品测定的均值加3倍标准差。如果经规范操作后所得检测限大于临界值时，说明试剂盒背景干扰大，试剂盒灵敏度不能满足检测要求，应与试剂盒厂家联系或弃去不用选用另外的试剂盒。
4 酶联免疫检测方法验证
在使用酶联免疫法检测样品时，应对方法进行验证。主要测定以下内容：
4．1 标准曲线的测定，标准曲线至少由5个浓度组成，测定次数不少于5次，以确定工作浓度范围和IC50范围。一般临界值为IC50附近，检测灵敏度高。
4．2 样品检测限的测定。
4．3 样品添加回收实验。对禁用药物可添加定量限和2倍定量限，对于有最高残留限量(MRL)的药物，可添加MRL和MRL上下各一个浓度。
准确度：若回收率大于40％符合相应检测标准的要求。精密度：批内变异系数每批平行样之间的变异系数小于或等于25％，对于禁用药物小于或等于30％。批间变异系数所有样品间变异系数小于或等于30％，对于禁用药物小于或等于40％。
满足以上准确度和精密度要求，说明酶联免疫方法可行，可用来检测药物残留。
5 其他
5．1 对于可用于多残留检测的试剂盒，以交叉反应率低的药物做阳性添加测定临界值(cut-off)。
5．2 实际检测样品时要包括以下实验：至少做两条标准曲线，两个阴性对照品，两个添加临界值(cut-off)的阳性对照品，两个平行的待检样品。检测结果出来后通过标准曲线形状(符合检测要求为S形)，IC50与临界值是否相近及阳性样品回收率，样品平行情况可确定检测是否可信。
近年来，疯牛病、瘦肉精事件的连续发生，人们震惊之余发现饲料在某种条件下不仅构成了对动物和人类健康的严重威胁，而且造成了意想不到的经济损失和巨大的政治影响。饲料安全作为食品安全中的一个源头环节，成了上至国际组织、政府部门，下至平民百姓，各个层面广泛关注的热点问题。世界上很多国家及非政府组织都积极加人了饲料、食品安全控制行列。各个国家与地区也都加大力度强化相关的组织机构，制定一系列的法律法规，如美国、日本修订了饲料安全法，欧盟成立了欧洲食品管理局，并将实行新的饲料食品管理法规，我国也颁布了《饲料和饲料添加剂管理条例》，实施了饲料安全工程。然而，再好的政策和措施都离不开饲料检测的技术支持，检测结果不仅是制定政策和标准如MRL的科学基础，也是采取重**律行动和解决贸易纠纷的重要依据。近年来，执行最有效、影响面最广的是饲料食品安全检测中有关违禁药品及兽药残留执法分析的逐级检测法。主要为筛选法、确证法和定量法。
筛选法是实施检测的第一步，用于大量样品的高通量分析。目的是检测某种或某类危害物是否存在。它简单快速不需要特殊的场地，不需要大型仪器设备，花费一般也较低。筛选法基于许多原理，但目前应用最多的是酶联免疫法(ELISA)。如饲料中违禁药品盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、安定、呋喃唑酮、己西雌酚的检测，尿液中盐酸克仑特罗、猪肝盐酸克仑特罗、牛奶中氯霉素的残留检测的各种试剂盒都属酶联免疫法(ELISA)。
自治区兽药饲料监察所从2000年就开始用酶联免疫法检测饲料中盐酸克仑特罗，到2004年开始大批量承担农业部及自治区下达的饲料安全检测项目，主要为饲料、饮水、尿液中盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、安定、呋喃唑酮、己西雌酚的检测。根据农业部要求首先用酶联免疫法进行筛选，检测出阳性者用高效液相色谱仪和气质联用仪进行确证和定量。本人就这几年应用酶联免疫法进行初筛检测中存在的问题及注意事项进行探讨，以供同行参考。
目前酶联免疫法检测用试剂盒种类繁多，有国外进口的，有国内自行研制生产的，如何在众多的品牌中选择既能满足检测要求又价格低廉的试剂盒是一个问题。本人根据使用这些试剂盒，在实际检测中发现，一般在试剂盒说明书中列出以下指标：最低检测限；回收率；交叉反应率；标准曲线图谱及数据，标准曲线至少由5个浓度组成；IC50测定值及变形曲线点数目的是比较规范的试剂盒，可以选择。
2 临界值(cut-off)的确定
在实际使用酶联免疫法检测时要首先确定临界值。通过检测结果与临界值的比较，可判定样品为阴性或可疑。对于禁用药物，检测方法的临界值为定量限，即现有的公认的仪器检测所能达到的最低定量限。对于有最高残留限量(MRL)的药物，检测方法的临界值为20份添加MRL浓度的样品重复3次测定的均值减去1．64倍标准差。检测结果如小于临界值为阴性，大于或等于临界值或标准规定为可疑，需要用确证法确证。
3 检测限的测定 可添加MRL和MRL上下各一个浓度。
每个试验室在使用酶联免疫法检测时，应做一下各自试验室的检测限。检测限为20份空白样品测定的均值加3倍标准差。如果经规范操作后所得检测限大于临界值时，说明试剂盒背景干扰大，试剂盒灵敏度不能满足检测要求，应与试剂盒厂家联系或弃去不用选用另外的试剂盒。
4 酶联免疫检测方法验证
在使用酶联免疫法检测样品时，应对方法进行验证。主要测定以下内容：
4．1 标准曲线的测定，标准曲线至少由5个浓度组成，测定次数不少于5次，以确定工作浓度范围和IC50范围。一般临界值为IC50附近，检测灵敏度高。
4．2 样品检测限的测定。
4．3 样品添加回收实验。对禁用药物可添加定量限和2倍定量限，对于有最高残留限量(MRL)的药物，可添加MRL和MRL上下各一个浓度。
准确度：若回收率大于40％符合相应检测标准的要求。精密度：批内变异系数每批平行样之间的变异系数小于或等于25％，对于禁用药物小于或等于30％。批间变异系数所有样品间变异系数小于或等于30％，对于禁用药物小于或等于40％。
满足以上准确度和精密度要求，说明酶联免疫方法可行，可用来检测药物残留。
5 其他
5．1 对于可用于多残留检测的试剂盒，以交叉反应率低的药物做阳性添加测定临界值(cut-off)。
5．2 实际检测样品时要包括以下实验：至少做两条标准曲线，两个阴性对照品，两个添加临界值(cut-off)的阳性对照品，两个平行的待检样品。检测结果出来后通过标准曲线形状(符合检测要求为S形)，IC50与临界值是否相近及阳性样品回收率，样品平行情况可确定检测是否可信。
