APAAP法检测淋巴细胞表面的IL-2
丁香园论坛
1742
分泌IL-2的淋巴细胞检测试剂（APAAP法）
T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群,在正常机体内各T淋巴细胞亚群相互作用,维持着机体正常的免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，就可导致机体免疫紊乱并发生一系列的病理变化。目前越来越多的研究证明，T淋巴细胞在各种临床疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、变态反应性疾病，再生障碍性贫血、病毒感染、恶性肿瘤等都有异常改变，在各种疾病的发生，发展过程中不同的T淋巴细胞又产生着极其重要的影响。在自身免疫性疾病（如活动性系统性红斑狼疮）中，T抑制/细胞毒细胞（CD8+）的数量和功能低下是发病的重要因素，有时也有T辅助/诱导细胞（CD4+）数量和功能的增高；在乙型肝炎、自身溶血性贫血、类分湿症，重症肌无力等患者都具有类似的T亚群异常的特征。CD4+/CD8+比值减少是免疫缺陷病的重要指征，在AIDS病人中就存在着CD4+细胞显著减少的现象；在一些上呼吸道感染的病人中CD8+细胞的数量和功能都有异常增高的现象。很多感染性疾病（如水痘、猩红热、麻疹病人）都和免疫抑制有关，CD4+/CD8+比值的倒置被认为是病毒感染性疾病的重要指征。在肿瘤病人外周血中T淋巴细胞亚群数值都有异常，其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少，而CD8+细胞明显增加，CD4+/CD8+比值显著降低，说明肿瘤病人的细胞免疫功能处于抑制状态，患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者外周血CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值明显下降。因此T淋巴细胞亚群的检测对控制这些疾病的发生、发展、了解发病机制、指导临床治疗都有极其重要的理论意义和临床意义，它已成为临床检验的一项重要指标。
T淋巴细胞亚群的分类方法最常用的是根据细胞表面标志，利用单克隆抗体将其分为不同功能亚群。抗CD2单抗与成熟T细胞表面E玫瑰花结实验的绵羊红细胞受体分子结合，用于检测人正常T细胞。抗CD3单抗与CD3抗原分子的ε链结合，是总T细胞的标志，抗CD4单抗与辅助/诱导功能T细胞反应，抗CD8单抗与抑制/细胞毒功能T细胞反应。
在静止的人T淋巴细胞表面存在有很少的IL-2受体，并且一般认为不分泌IL-2，只有活化的淋巴细胞才能分泌IL-2，所以分泌IL-2是T淋巴细胞活化的标志之一。
使用方法：
一、标本的制备：取PHA刺激和正常的Jurkat细胞进行涂片。涂片要用清洁玻片，最好用酸处理，然后经水洗后放95%乙醇中，从乙醇中取出用干净纱布擦干净。涂片不应太厚，厚玻片在染色过程中易脱落。
涂片前取5粘片剂均匀推片或用棉签沾取粘片剂，均匀涂于干净玻片上，干后制备细胞涂片，有利于细胞黏附。
二、标本的保存： 标本如不进行染色，干燥后，用铝铂纸或塑料纸包起来密闭防潮，标本最好放干燥器中，放–20℃可保存半年至一年而抗原不会丢失。标本在室温可以保存3-5天，长期保存会因抗原丢失而不能染色。固定前将标本从冰冻状态取出，使其恢复至室温后再打开包。
三、标本的染色：
1. 细胞涂片标本室温干燥2小时以上或过夜，画圈笔在标本外花圈，然后滴加固定液于标本上，固定1-2分钟后PBS洗。
2. 加抗IL-2单克隆抗体10-15µl，放湿盒20-30分钟。
3. 加羊抗鼠 IgG二抗10-15µl，室温20-30 分钟。
4. 加APAAP(碱性磷酸酶)复合物10-15µl，室温20-30分钟。
如需增加染色程度，可重复3-4步骤，每步骤10分钟。
5. 加碱性磷酸酶底物显色：临用前取底物液，加入少许坚固红，充分混匀。取20-40µl加于标本上，室温或37℃湿箱显色15-30分钟，在低倍显微镜下观察，可见到细胞膜上出现红色标记物，待显色很明显时，用自来水洗终止显色。
以上实验均须将标本放于湿盒内以防止抗体蒸发。每步骤间均用0.01MpH7.2PBS液洗三次。
6. 加苏木素复染液一滴复染1-2分钟，自来水洗，如果核着色很深影响染色时，可用1%HCL分色5-10秒钟，再自来水冲洗。
7. 甘油明胶封片：如标本需长期保存时，可将封片剂瓶放热水中融化 ，加一滴于标本上或加于盖片上封片，镜检。如果不需保存，可加一滴水于标本上加盖片后观察，标本干燥后细胞形态不宜观察。
高倍镜下观察，细胞核呈兰色，细胞表面有红色标记物的细胞为阳性细胞，无红色标记物的细胞为阴性细胞，记数100-200个单个核细胞，计算阳性细胞百分率。
T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群,在正常机体内各T淋巴细胞亚群相互作用,维持着机体正常的免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，就可导致机体免疫紊乱并发生一系列的病理变化。目前越来越多的研究证明，T淋巴细胞在各种临床疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、变态反应性疾病，再生障碍性贫血、病毒感染、恶性肿瘤等都有异常改变，在各种疾病的发生，发展过程中不同的T淋巴细胞又产生着极其重要的影响。在自身免疫性疾病（如活动性系统性红斑狼疮）中，T抑制/细胞毒细胞（CD8+）的数量和功能低下是发病的重要因素，有时也有T辅助/诱导细胞（CD4+）数量和功能的增高；在乙型肝炎、自身溶血性贫血、类分湿症，重症肌无力等患者都具有类似的T亚群异常的特征。CD4+/CD8+比值减少是免疫缺陷病的重要指征，在AIDS病人中就存在着CD4+细胞显著减少的现象；在一些上呼吸道感染的病人中CD8+细胞的数量和功能都有异常增高的现象。很多感染性疾病（如水痘、猩红热、麻疹病人）都和免疫抑制有关，CD4+/CD8+比值的倒置被认为是病毒感染性疾病的重要指征。在肿瘤病人外周血中T淋巴细胞亚群数值都有异常，其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少，而CD8+细胞明显增加，CD4+/CD8+比值显著降低，说明肿瘤病人的细胞免疫功能处于抑制状态，患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者外周血CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值明显下降。因此T淋巴细胞亚群的检测对控制这些疾病的发生、发展、了解发病机制、指导临床治疗都有极其重要的理论意义和临床意义，它已成为临床检验的一项重要指标。
T淋巴细胞亚群的分类方法最常用的是根据细胞表面标志，利用单克隆抗体将其分为不同功能亚群。抗CD2单抗与成熟T细胞表面E玫瑰花结实验的绵羊红细胞受体分子结合，用于检测人正常T细胞。抗CD3单抗与CD3抗原分子的ε链结合，是总T细胞的标志，抗CD4单抗与辅助/诱导功能T细胞反应，抗CD8单抗与抑制/细胞毒功能T细胞反应。
在静止的人T淋巴细胞表面存在有很少的IL-2受体，并且一般认为不分泌IL-2，只有活化的淋巴细胞才能分泌IL-2，所以分泌IL-2是T淋巴细胞活化的标志之一。
使用方法：
一、标本的制备：取PHA刺激和正常的Jurkat细胞进行涂片。涂片要用清洁玻片，最好用酸处理，然后经水洗后放95%乙醇中，从乙醇中取出用干净纱布擦干净。涂片不应太厚，厚玻片在染色过程中易脱落。
涂片前取5粘片剂均匀推片或用棉签沾取粘片剂，均匀涂于干净玻片上，干后制备细胞涂片，有利于细胞黏附。
二、标本的保存： 标本如不进行染色，干燥后，用铝铂纸或塑料纸包起来密闭防潮，标本最好放干燥器中，放–20℃可保存半年至一年而抗原不会丢失。标本在室温可以保存3-5天，长期保存会因抗原丢失而不能染色。固定前将标本从冰冻状态取出，使其恢复至室温后再打开包。
三、标本的染色：
1. 细胞涂片标本室温干燥2小时以上或过夜，画圈笔在标本外花圈，然后滴加固定液于标本上，固定1-2分钟后PBS洗。
2. 加抗IL-2单克隆抗体10-15µl，放湿盒20-30分钟。
3. 加羊抗鼠 IgG二抗10-15µl，室温20-30 分钟。
4. 加APAAP(碱性磷酸酶)复合物10-15µl，室温20-30分钟。
如需增加染色程度，可重复3-4步骤，每步骤10分钟。
5. 加碱性磷酸酶底物显色：临用前取底物液，加入少许坚固红，充分混匀。取20-40µl加于标本上，室温或37℃湿箱显色15-30分钟，在低倍显微镜下观察，可见到细胞膜上出现红色标记物，待显色很明显时，用自来水洗终止显色。
以上实验均须将标本放于湿盒内以防止抗体蒸发。每步骤间均用0.01MpH7.2PBS液洗三次。
6. 加苏木素复染液一滴复染1-2分钟，自来水洗，如果核着色很深影响染色时，可用1%HCL分色5-10秒钟，再自来水冲洗。
7. 甘油明胶封片：如标本需长期保存时，可将封片剂瓶放热水中融化 ，加一滴于标本上或加于盖片上封片，镜检。如果不需保存，可加一滴水于标本上加盖片后观察，标本干燥后细胞形态不宜观察。
高倍镜下观察，细胞核呈兰色，细胞表面有红色标记物的细胞为阳性细胞，无红色标记物的细胞为阴性细胞，记数100-200个单个核细胞，计算阳性细胞百分率。
