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APAAP法检测淋巴细胞表面的IL-2

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分泌IL-2的淋巴细胞检测试剂(APAAP法)

T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群,在正常机体内各T淋巴细胞亚群相互作用,维持着机体正常的免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时,就可导致机体免疫紊乱并发生一系列的病理变化。目前越来越多的研究证明,T淋巴细胞在各种临床疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、变态反应性疾病,再生障碍性贫血、病毒感染、恶性肿瘤等都有异常改变,在各种疾病的发生,发展过程中不同的T淋巴细胞又产生着极其重要的影响。在自身免疫性疾病(如活动性系统性红斑狼疮)中,T抑制/细胞毒细胞(CD8+)的数量和功能低下是发病的重要因素,有时也有T辅助/诱导细胞(CD4+)数量和功能的增高;在乙型肝炎、自身溶血性贫血、类分湿症,重症肌无力等患者都具有类似的T亚群异常的特征。CD4+/CD8+比值减少是免疫缺陷病的重要指征,在AIDS病人中就存在着CD4+细胞显著减少的现象;在一些上呼吸道感染的病人中CD8+细胞的数量和功能都有异常增高的现象。很多感染性疾病(如水痘、猩红热、麻疹病人)都和免疫抑制有关,CD4+/CD8+比值的倒置被认为是病毒感染性疾病的重要指征。在肿瘤病人外周血中T淋巴细胞亚群数值都有异常,其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少,而CD8+细胞明显增加,CD4+/CD8+比值显著降低,说明肿瘤病人的细胞免疫功能处于抑制状态,患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降,形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中,患者外周血CD4+细胞数减少,CD8+细胞数增多,CD4+/CD8+比值明显下降。因此T淋巴细胞亚群的检测对控制这些疾病的发生、发展、了解发病机制、指导临床治疗都有极其重要的理论意义和临床意义,它已成为临床检验的一项重要指标。
T淋巴细胞亚群的分类方法最常用的是根据细胞表面标志,利用单克隆抗体将其分为不同功能亚群。抗CD2单抗与成熟T细胞表面E玫瑰花结实验的绵羊红细胞受体分子结合,用于检测人正常T细胞。抗CD3单抗与CD3抗原分子的ε链结合,是总T细胞的标志,抗CD4单抗与辅助/诱导功能T细胞反应,抗CD8单抗与抑制/细胞毒功能T细胞反应。
在静止的人T淋巴细胞表面存在有很少的IL-2受体,并且一般认为不分泌IL-2,只有活化的淋巴细胞才能分泌IL-2,所以分泌IL-2是T淋巴细胞活化的标志之一。

使用方法:
一、标本的制备:取PHA刺激和正常的Jurkat细胞进行涂片。涂片要用清洁玻片,最好用酸处理,然后经水洗后放95%乙醇中,从乙醇中取出用干净纱布擦干净。涂片不应太厚,厚玻片在染色过程中易脱落。
涂片前取5粘片剂均匀推片或用棉签沾取粘片剂,均匀涂于干净玻片上,干后制备细胞涂片,有利于细胞黏附。
二、标本的保存: 标本如不进行染色,干燥后,用铝铂纸或塑料纸包起来密闭防潮,标本最好放干燥器中,放–20℃可保存半年至一年而抗原不会丢失。标本在室温可以保存3-5天,长期保存会因抗原丢失而不能染色。固定前将标本从冰冻状态取出,使其恢复至室温后再打开包。
三、标本的染色:
1.  细胞涂片标本室温干燥2小时以上或过夜,画圈笔在标本外花圈,然后滴加固定液于标本上,固定1-2分钟后PBS洗。
2.  加抗IL-2单克隆抗体10-15µl,放湿盒20-30分钟。
3.  加羊抗鼠 IgG二抗10-15µl,室温20-30 分钟。
4.  加APAAP(碱性磷酸酶)复合物10-15µl,室温20-30分钟。
如需增加染色程度,可重复3-4步骤,每步骤10分钟。
5.  加碱性磷酸酶底物显色:临用前取底物液,加入少许坚固红,充分混匀。取20-40µl加于标本上,室温或37℃湿箱显色15-30分钟,在低倍显微镜下观察,可见到细胞膜上出现红色标记物,待显色很明显时,用自来水洗终止显色。
以上实验均须将标本放于湿盒内以防止抗体蒸发。每步骤间均用0.01MpH7.2PBS液洗三次。
6.  加苏木素复染液一滴复染1-2分钟,自来水洗,如果核着色很深影响染色时,可用1%HCL分色5-10秒钟,再自来水冲洗。
7.  甘油明胶封片:如标本需长期保存时,可将封片剂瓶放热水中融化 ,加一滴于标本上或加于盖片上封片,镜检。如果不需保存,可加一滴水于标本上加盖片后观察,标本干燥后细胞形态不宜观察。
高倍镜下观察,细胞核呈兰色,细胞表面有红色标记物的细胞为阳性细胞,无红色标记物的细胞为阴性细胞,记数100-200个单个核细胞,计算阳性细胞百分率。
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