备选方案5：直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原

一、附加材料（其他材料见基本方案）

1. 细胞样品

2. 碱性磷酸酶标记的特异性抗体 V冰冷的洗涤缓冲液

3. 25%（m/V）戊二醛（EM级；Sigma），可选用

4. PBSLE: PBS（附录1），加100 mmol/L赖氣酸或100 mmol/L乙醇胺，可选用 锥底或圆底微量滴定板

二、实验方法

1. 使用不同数量的阳性和阴性对照细胞样品和不同浓度碱性磷酸酶标记抗体，十字交 叉连续稀释分析法确定每孔添加的最适细胞数和酶标抗体最适浓度（见辅助方案）。开始时以每孔1 X 10^5〜5 X 10^5 个细胞和0.5〜10 μg/ml 酶标抗体滴定。

   预试验中仅加入底物孵育，检测待测细胞本身是否表达碱性磷酸酶。如果表达 量较大，影响酶标抗体的敏感性，则用另一种酶标记复合物，如β-半乳糖苷酶。

2. 使用台式离心机，将细胞样品加入 15 ml 或 50 ml 离心管，4°C，450 g 离心 5 min。计 数细胞量（附录 3A），并用冰冷的洗涤缓冲液重新将细胞混勻，配制成 1 X 10^6〜5 X 10^6 个细胞/ml（步骤 3）。

3. 可选：用 0.5%（V/V）戊二醛（终浓度）固定细胞并混匀，室温下孵育 30 min。离 心沉淀细胞，去上清液，用 PBSLE 重新悬浮细胞，37°C 下孵育 30 min。用 PBSLE 洗涤 2 次并用洗涤缓冲液重新混匀。如需要，可 4°C 下储存细胞数月。

   如固定后细胞表面抗原仍保持其抗原性，可在实验开始时就固定细胞。

4. 将 100ul 细胞悬液（1 X 10^5 〜5 X10^5个细胞）加入锥底或圆底微量滴定板孔中， 4°C，450 g 离心 lmin。真空吸去上清液，将微量滴定板置于振荡器或微量滴定板摇 床上，悬浮沉淀物。

5. 用 100ul 最适浓度的酶标抗体（步骤 1），在冰冷洗涤缓冲液中重新混匀沉淀物。4°C 下孵育 1.5 h，每隔 15 min 柔和摇动微量板重新混匀细胞，注意不要使细胞悬液溅出 孔板。

6. 4°C，450 g 离心细胞 1 min，真空吸去上清液，振摇悬浮沉淀物，加入 200u1 冰冷的 洗涤缓冲液重新将其混勻，重复 3 次。

7. 加入 100ul MUP 或 NPP 底物溶液。室温下孵育 1 h，显色过程中，每隔 15 min 柔和 摇动微量板混匀细胞。目测或使用微量滴定板检测仪（见基本方案，步骤 9）确定显色程度。